气相色谱-正化学源质谱法同时测定焦糖色素中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑

乔青青，郝莉花*，巩凡，葛静，方裕科

1(河南省产品质量监督检验院，河南 郑州，450000)2(河南省食品安全数据智能重点实验室，河南 郑州，450000)3(仲恺农业工程学院，广东 广州，510000)

焦糖色素是一种世界广泛使用的食品色素，占整个食品着色剂使用量的90%以上[1]，由于它具有棕褐色色泽、良好的口感和稳定性，被广泛用于食醋、酱油、饮料和啤酒等水溶性食品中[2]。国际技术焦糖色素协会根据生产过程中所采用的反应剂把焦糖色素分为四类，分别为普通法(Ⅰ类)、苛性硫酸盐法(Ⅱ类)、氨法(Ⅲ类)和亚硫酸铵法(Ⅳ类)[3]。其中，Ⅲ类和Ⅳ类焦糖色素在制作过程中会产生副产物4-甲基咪唑[4]。

4-甲基咪唑是具有多元毒性的化合物，其毒理学性质包括：抑制细胞色素P450同功酶、在人的肝脏中发生催化反应、产生许多低分子质量致癌物、诱发动物惊厥、导致甲状腺肿瘤和白血病的风险[5-8]。因此，我国的食品安全国家标准中规定4-甲基咪唑的含量不得高于200 mg/kg，同时对不同食品中焦糖色的含量也进行了限定[3,9]。2-甲基咪唑是4-甲基咪唑的同分异构体，目前，国内外均未对这两类甲基咪唑进行明确的限量规定，但其污染的风险性仍无法排除[4]。因此，准确测定焦糖色中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑十分重要。

检测焦糖色素和食品中2-甲基咪唑、4-甲基咪唑的方法主要有纸层析法、分光光度法、气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、气相色谱-串接质谱法、液相色谱串接质谱法等。早期研究中所用的纸层析法以定性为主，定量误差较大[10-11]。GB 1886.64—2015中规定4-甲基咪唑的检测方法为气相色谱法(火焰离子化检测器，flame ionization detector，FID检测器)。对于这种小分子化合物FID检测器响应较差，当前毛细管色谱柱超量进样又会导致进样过载，峰宽大且严重拖尾，加之其他化合物对基线的影响，容易出现假阳性，定量不准确的问题。液相色谱法需要对样品衍生，重现性较低[12]。

最近的研究将检测重点转移至质谱领域，所开发的方法较多，仅2019—2020年，在中文文献中检索到多篇串接质谱检测2-甲基咪唑、4-甲基咪唑的研究，其中5篇为液相串接质谱法。王颖等[13]采用超高效液相色谱-串联质谱法测定豆制品中3种甲基咪唑类化合物含量；王爱军[14]采用气相色谱串联三重四级杆质谱测定焦糖色中4-甲基咪唑含量；王冰玉等[15]采用高效液相色谱法测定咪唑生产工艺中反应液中咪唑及2种杂质：2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量；公丕学等[16]采用固相萃取UPLC-MS/MS测定黄酒中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量；钮正睿等[17]采用超高效液相色谱-串联质谱法检测保健食品中4-甲基咪唑含量。液相、气相串接质谱法能够有效排除杂质干扰，测定结果准确，虽然通用性好，但是仪器较昂贵，检测成本高。相比串接质谱，气相单级质谱也能测定[18]，但常用的电子轰击电离(electron ionization，EI)源不具有选择性，低分子质量的甲基咪唑容易受到多杂质干扰，继而出现较多假阳性。与许多含氮化合物一样，由于咪唑氮原子具有化学反应活性，因此可以采用具有特殊选择性的离子源模式，如正化学源模式对少数含氮化合物有响应，对很多杂质没有响应，可以消除多数无法离子化杂质的干扰[19-20]，不易出现假阳性。

本研究采用气相色谱-正化学源质谱法检测甲基咪唑，选择适宜的前处理方式并优化前处理条件和仪器参数，建立了同时测定焦糖色中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的方法。该方法具有高度选择性，能够避免单击质谱条件下杂质的干扰，获得较好的检出限和精密度。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：2-甲基咪唑(纯度99.4%)、4-甲基咪唑(纯度99.1%)，Bepure公司；硅藻土，美国Supelco公司；焦糖色素(市售)；正己烷，美国Tedia公司；二氯甲烷(色谱级)，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；三氯甲烷(色谱级)、丙酮(色谱级)， 烟台市双双化工有限公司；乙酸乙酯(色谱级)、乙腈(色谱级)，霍尼韦尔贸易(上海)有限公司；氢氧化钠(分析纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司；三级水，实验室自制。

仪器：Agilent 7200气相色谱串联质谱仪(配有可切换的EI、CI源)，美国安捷伦公司；Vortex Mixer QL-866旋涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；FA2004 N电子天平，上海箐海仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

在50 mL离心管中准确称取(0.5±0.02) g焦糖色，加入250 μL氢氧化钠溶液(氢氧化钠水溶液3 mol/L)混合均匀。加入少量硅藻土，旋盖后涡旋混匀，继续添加硅藻土混匀直至形成半干、均匀的混合物(离心管壁上不粘有焦糖色)。上述混合物完全转移至带有砂芯漏斗的玻璃柱中，少许开启旋塞，将洗脱溶剂倾倒至柱中，待溶剂通过色谱柱流至旋塞时关闭旋塞，溶剂停留在柱层中5 min。打开旋塞，继续添加溶剂并收集洗脱液10～15 mL(控制流速5 mL/min)，并定容至20 mL，混合均匀；定容液过0.22 μm有机膜，置于进样小瓶中，待上机。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：DB-WAXetr(30 m×320 μm×1 μm)。载气：He；流量：2 mL/min；进样口温度：220 ℃。进样模式：脉冲不分流。程序升温：40 ℃保持1 min，5 ℃/min至115 ℃，后运行260 ℃(3 mL/min)保持5 min，传输线温度：280 ℃。

1.2.3 质谱条件

离子源：化学源；模式：正模式(正化学电离，positive chemical ionization，PCI模式)；离子源温度：300 ℃；发射电流：4.4 μA；电子能量：240 eV。采集模式：Scan，扫描m/z=35～100，采集频率:5质谱图/s。EI源根据文献[14]中的条件设置。

1.2.4 标准溶液配制

准确称量2-甲基咪唑和4-甲基咪唑标准品(0.01 g)，用乙酸乙酯定容至10 mL，配制质量浓度为1 000 μg/mL标准储备液D1；准确量取1.00 mL标准储备液D1，用乙酸乙酯定容至100 mL，配制成10 μg/mL储备液D2；量取50、100、200、400、800 μL储备液D2，分别加入乙酸乙酯定容至1 mL，配制质量浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL的标准溶液。

2 结果与分析

2.1 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑质谱采集模式的研究

2.1.1 PCI模式

研究采用1.2.2色谱条件，分别用EI、PCI、负化学电离(negative chemical ionization，NCI)3种离子源模式电离并测定储备液D2，获得2-甲基咪唑和4-甲基咪唑色谱图(图1)和质谱图(图2)。

由图1可以看出，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑保留时间分别为8.480和8.992 min，EI模式下和NIST14库匹配度>80%，化合物定性准确；PCI模式下，在相同保留时间仍可以发现峰形较好的2个峰，质谱图(图2)主要m/z为83、84、82，因此选择m/z=83为定量离子，m/z=84和82为定性离子。

a-EI模式；b-PCI模式图1 质量浓度为10 μg/mL的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑色谱图Fig.1 Chromatograms of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole in the level of 10 μg/mL

a-EI模式下2-甲基咪唑；b-EI模式下4-甲基咪唑；c-PCI模式下2-甲基咪唑；d-PCI模式下4-甲基咪唑图2 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑在EI、PCI模式下的质谱图Fig.2 MASS chromatogram of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole in the mode of PCI-MS /MS and EI-MS/MS

2.1.2 PCI条件下MS/MS模式

采用1.2.2色谱条件，在PCI模式基础上测定研究储备液D2的MS/MS产物离子，优化碰撞能量5、10、15、20、25 V，最终得到产物离子最丰富的碰撞能量为15 V，产物离子图见图3。母离子m/z=83产生的子离子主要为m/z=42和56，因此，如果采用PCI模式串接三重四极杆质谱检测，应选择定量离子m/z=83→42(碰撞能量15 V)、定性离子m/z=83→56(碰撞能量15 V)。

a-2-甲基咪唑；b-4-甲基咪唑图3 PCI模式下MS/MS产物离子图Fig.3 The ion chromatograms in the mode of PCI

2.2 前处理方法的选择与优化

2.2.1 洗脱剂的选择

采用文献[14]所述方法在样品焦糖色中检出98 mg/kg 4-甲基咪唑，2-甲基咪唑未检出，因此本研究在样品中添加100 mg/kg的2-甲基咪唑，制备待测样品S1并对前处理的方法选择和优化。

将制备的待测样品S1，采用1.2.1所述前处理方法，选取不同种类洗脱剂(正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、丙酮)50 mL洗脱样品并按照2.1.1所述PCI单极质谱方法检测，以回收率为指标选择合适溶剂，每组实验重复2次，结果见表1。

由表1可以看出，正己烷无法洗脱待测物(回收率为0%)，因此不适合作为洗脱剂，但可用作复杂体系除脂。二氯甲烷作为洗脱剂时，对4-甲基咪唑回收率107.12%，2-甲基咪唑回收率仅为67.11%，因此不适合同时检测2种化合物。

表1 洗脱剂种类对2-甲基咪唑和4-甲基咪唑洗脱回收率的影响(n=3)Table 1 Influence of different eluents on recoveries of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole (n=3)

三氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯为洗脱剂时对2种化合物洗脱效果较好，但其中三氯甲烷毒性较大且产生较强的基质放大效应(回收率121.25%)，乙腈极性较大，洗脱后待测液颜色较深，均不适合作为洗脱剂。乙酸乙酯洗脱后回收率接近100%，溶剂毒性较小，因此选择乙酸乙酯作为本研究的洗脱剂。此外，由于丙酮洗脱后焦糖色素大量溶出，无法产生有效净化效果，因此不适合作洗脱剂。

2.2.2 洗脱液用量

采用乙酸乙酯作为洗脱剂，将制备的待测样品S1，采用1.2.1所述前处理方法测定，并按照2.1.1所述PCI单极质谱方法检测，考察洗脱液用量对2-甲基咪唑和4-甲基咪唑洗脱回收率，结果如表2所示。

表2 洗脱液体积对2-甲基咪唑和4-甲基咪唑洗脱回收率的影响(n=3)Table 2 Influence of different eluents volume on recoveries of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole (n=3)

由表2可以看出，随着洗脱液用量增加，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑回收率呈上升趋势，超过10 mL时回收率接近100%，继续增加溶剂的洗脱量不仅不会增加回收率，反而使精密度和回收率下降，这可能是因杂质的量增加而导致基质效应影响显著导致。因此，本研究洗脱液体积选择为10～15 mL。

2.2.3 线性范围、定量限、精密度、回收率

配制0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑标准系列浓度进行测定，按照2.1.1所述PCI单极质谱方法检测，以定量离子峰面积S为纵坐标，质量浓度ρ(μg/mL)为横坐标绘制标准工作曲线，2-甲基咪唑标准溶液在0.5～0.8 μg/mL范围内，线性回归方程为y=10 099x+6 279，相关系数R2=0.999 7，4-甲基咪唑标准溶液在0.5～0.8 μg/mL范围内，线性回归方程为y=8 836x+8 824，相关系数R2=0.999 4，线性均较好。

按照3倍性噪比计算检出限，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑仪器检出限均为0.5 μg/mL，称样量为0.5 g，定容体积20 mL时，方法检出限为20 mg/kg，满足焦糖色中4-甲基咪唑含量的检验要求(限量值为200 mg/kg)。对2-甲基咪唑空白焦糖色样品加标，考察了3个加标水平(20、80和320 mg/kg)，每个水平平行试验3次(n=3)，计算测得样品的加标回收率为102.1%～107.9%，通过相对标准偏差衡量试验精密度，相对标准偏差值为1.33%～5.79%，具体见表3。

表3 焦糖色素中2-甲基咪唑加标回收率及相对标准偏差(n=3)Table 3 Recoveries and precisions of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole in caramel pigment(n=3)

3 结论与讨论

本研究采用气相色谱-正化学源质谱法检测甲基咪唑类物质，样品经碱化处理后，用硅藻土净化，10～15 mL乙酸乙酯洗脱，在0.5～8.0 μg/mL范围内线性良好，该方法2种物质的方法检出限均为20 mg/kg；在20、80、320 mg/kg 3个水平下，2-甲基咪唑的回收率为102.1%～107.9%，相对标准偏差(n=3)为1.33%～5.79%。

EI模式没有选择性，甲基咪唑类分子质量低容易受到杂质干扰，PCI模式对2-甲基咪唑及4-甲基咪唑都有较好的响应，对很多杂质没有响应，可消除多数无法离子化杂质的干扰，不易出现假阳性。该方法简单、快速、高效，可用于同时测定焦糖色素中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑。