蛋白酶处理对脱脂乳感官品质及游离氨基酸的影响

2021-08-31 02:34梁肖娜钱冠林岳喜庆
食品科学 2021年16期
关键词:脱脂牛乳苦味

程 娇,孙 敬,梁肖娜,钱冠林,岳喜庆,郑 艳

(沈阳农业大学食品学院,辽宁 沈阳 110866)

医学之父希波克拉底曾指出“牛奶是最接近完善的食物”,牛乳富含的蛋白质不仅可为人类生理活动提供能量与必需氨基酸,还具有较高的营养价值和功能特性,但大量的研究结果显示,由于牛乳和人乳蛋白成分上的差异性[1],常会导致过敏性哮喘、鼻炎、皮肤湿疹、消化功能紊乱等疾病[2],据报道约3%的成年人经历过对乳制品过敏[3]。因此,在保证牛乳营养成分的基础上,为满足现代食品开发与加工的需要,利用酶解技术对牛乳蛋白质进行开发和改性,己成为食品加工行业关注的焦点[4-5]。

其中生物酶解技术对牛乳进行改性,因具有脱敏效率高,反应条件温和且绿色环保的特点而备受关注[6-8]。酶解处理的牛乳蛋白,在抗原性降低的同时,也会生成大量易于人体吸收的小分子肽及游离氨基酸等物质[9],并且牛乳蛋白空间结构及一级结构的改变,会引起滋味物质与蛋白质之间的相互作用以及蛋白胶束的改变,进而影响牛乳的感官品质[10]。同时,不同蛋白酶及酶解进程存在差异,也会对牛乳中游离氨基酸及色泽滋味等感官品质产生不同影响。目前,牛乳酶解改性的研究主要以提纯的乳清蛋白或酪蛋白为研究对象,考察酶解处理对致敏蛋白抗原性、分子结构及理化性质的影响[11-13],但是以牛乳为研究对象,考察蛋白酶种类以及酶解时间对牛乳感官品质及游离氨基酸含量的影响,却少见报道。

本实验在前期工作基础上,选取碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶为研究对象,以脱脂牛乳为原料,脱脂处理更利于酶解[14],拟利用电子舌、氨基酸分析仪等现代仪器感官检测技术,分析酶解处理对脱脂牛乳色泽、滋味及游离氨基酸含量的影响,以便酶解技术及其产物更好地应用于食品工业中,以期扩大牛乳的食用人群,辅助低敏性乳制品的研发,为实现乳制品的多样化生产提供原料和技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜脱脂牛乳 辽宁省辉山乳业有限公司;碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶 丹麦Novozymes公司;氨基酸混合标准品 美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

DK-98-IIA水浴锅 美国Finnigan公司;CR21N离心机美国惠普公司;UV-1800紫外-可见光分光光度计 日本岛津公司;NS810分光测色仪 中国3nh公司;SA402B电子舌 日本Insent公司;L-8900高效全自动氨基酸分析仪 日本日立高新技术公司。

1.3 方法

1.3.1 脱脂牛乳酶解处理

依据表1酶解条件,水浴加热至52.5 ℃时,准确量取脱脂牛乳150 mL(蛋白质含量5.25 g)及蛋白酶。蛋白酶添加活力依据表1所示的酶活力-底物比计算,然后依据比活力确定脱脂乳中蛋白酶添加量。分别预热称量好脱脂乳和蛋白酶各20 min,将碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶分别加入脱脂牛乳中酶解15、30、60、90、120、180、240 min,到达水解时间后,升温至中心温度90 ℃,维持10 min对酶进行灭活,然后迅速冷却至25 ℃左右室温后备用。

表1 3 种蛋白酶水解条件Table 1 Hydrolysis conditions of three proteases

1.3.2 水解度测定

采用邻苯二甲醛法[15]。

1.3.3 蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝法[16]。

1.3.4 干物质含量测定

采用直接干燥法[17],依据GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》[18]方法进行测定和计算。

1.3.5 色泽测定

将分光测色仪经过校准后,将酶解液导入平皿,放置在背景板上,对样品进行测定,每组样品测定3 次。

1.3.6 电子舌测定

电子舌采取人工脂膜传感器技术,可以客观地数字化评价样品的味觉感官指标。将样品置于电子舌专用测试杯(35 mL)中,对其酸、苦、涩、咸、鲜、甜味等基本味觉及苦味回味、涩味回味、鲜味回味(丰富度)进行测定,取测量数据的3 次平均值进行数据分析。

1.3.7 游离氨基酸测定

取酶解物与0.1%磺基水杨酸溶液以体积比4∶1的比例混匀,制作为样品,置于4 ℃冰箱静置60 min后,于4 ℃、10 000 r/min离心5 min,取上清液,将样品经0.22 µm微孔滤膜后经氨基酸自动分析仪测定。

色谱条件[19-20]:分析柱(60 mm×4.6 mm)柱温为57.0 ℃,反应柱温度为135 ℃,泵1流速为0.45 mL/min,泵2流速为0.35 mL/min,进样量20 µL。紫外检测器:脯氨酸在440 nm波长处测定吸光度,其他氨基酸在570 nm波长处测定吸光度,根据下式计算游离氨基酸含量:

式中:Ci为游离氨基酸浓度/(nmol/mL);V为样品体积/mL;F为稀释倍数(50);M为氨基酸摩尔质量/(g/mol);m为酶解物质量/g。

1.4 数据统计与分析

用Excel、SPSS进行数据整理分析及显著性检验,P<0.05,差异显著,采用Origin 2020b软件绘图。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶处理对脱脂牛乳水解度及蛋白含量的影响

水解度是衡量水解效果的重要参数,决定了水解物的酶解特性[21],并且研究表明,水解物微观及宏观特性的改变取决于酶类型和水解过程,特别是水解时间[22],实验考察了脱脂牛乳在碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶作用下,水解度随时间的变化情况,图1A结果表明,随着酶解时间延长,3 种蛋白酶酶解物的水解度逐渐增加,碱性蛋白酶、复合蛋白酶在酶解60 min,风味蛋白酶在酶解90 min时,3 种蛋白酶酶解物的水解度趋于平稳,是由于酶解反应之初,底物含量高,遵循零级反应,水解度呈迅速上升趋势,随着酶解时间的延长底物消耗殆尽,酶饱和后遵循一级反应,水解度逐渐趋于稳定,在酶解4 h时,风味蛋白酶水解度(24.61%)>碱性蛋白酶(10.6%)>复合蛋白酶(9.51%)。结合图1B可知,与对照组相比,酶解产物蛋白质量浓度均显著下降;且随着酶解时间的延长及水解度的增加,牛乳酶解产物呈现明显下降趋势,说明酶解处理会引起蛋白质量浓度降低,并且酶解程度及时间与蛋白质量浓度均呈负相关。

图1 蛋白酶处理对脱脂牛乳水解度(A)、蛋白含量(B)的影响Fig. 1 Effect of protease treatment on the degree of hydrolysis (A) and protein concentration (B) of skim milk

2.2 蛋白酶处理对脱脂牛乳干物质含量的影响

乳制品中干物质含量是反映牛乳品质及质量的重要指标,同时也是乳制品加工过程中原料奶标准化及保证产品质量的重要依据[17]。从图2可以看出,与对照组相比,经过蛋白酶处理的脱脂乳,其干物质含量略有减少,但碱性蛋白酶及复合蛋白酶处理组无显著差异,风味蛋白酶处理组在酶解120 min后显著下降(P<0.05),可能是由于酶解处理引起牛乳体系稳定性改变,生成小分子低沸点的水溶性物质,在干燥加热过程中损失部分干物质。

图2 蛋白酶处理对脱脂牛乳干物质含量的影响Fig. 2 Effect of protease treatment on the dry matter content of skim milk

2.3 蛋白酶处理对脱脂牛乳色泽的影响

食品色泽是影响消费者购买力的主要因素之一,而原料色泽也是影响终端产品的关键因素[23]。从图3可知,酶解后脱脂牛乳色泽变化明显。与对照组相比,碱性蛋白酶处理60 min、风味蛋白酶处理30 min后,原料乳特有的乳白色逐渐消失;而复合蛋白酶处理15 min后,其乳白色已基本丧失。此现象可能与脱脂乳中蛋白降解引起的蛋白胶束含量降低及蛋白粒径改变有关[10]。

图3 蛋白酶处理对脱脂牛乳色泽的影响Fig. 3 Effect of protease treatment on the color of skim milk

通过分光测色仪,采用CIELAB表示并检测不同蛋白酶及酶解过程中,脱脂牛乳色泽的变化情况,以脱脂牛乳L*=71.94、a*=-2.50、b*=-3.02为对照标准样品,其白度大,色泽明亮,呈现绿色,且因脱脂后,脂肪含量变少,呈现蓝色[23-24],首先与对照组相比,由图4~6可知,在不同时间条件下,经过3 种蛋白酶处理的原料乳,其亮度L*、红度a*、黄度b*值都出现显著(P<0.05)变化,其中L*值均显著(P<0.05)下降,其变化与蛋白胶束稳定性有关,变性的蛋白胶束分裂,粒径减少使脱脂乳的透光性增加,进而导致L*降低[25],a*(负值)均显著上升(P<0.05),碱性蛋白酶b*在120 min前显著下降(P<0.05),之后显著上升(P<0.05),风味蛋白酶在60 min前显著下降(P<0.05),之后显著上升(P<0.05),而复合蛋白酶酶解产物在第30 分钟显著下降。

进一步分析在蛋白酶酶解过程中,3 种蛋白酶处理的脱脂牛乳随着酶解时间的变化情况,由图4可知,随着酶解时间的延长,亮度(L*值)继续变暗,碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶分别在酶解120、30、60 min后L*值变化不显著(P>0.05);a*、b*值呈显著(P<0.05)增加趋势,碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶分别在酶解120、60、60 min后a*值变化不显著(P>0.05),碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶在120 min后b*值变化不显著(P>0.05),说明与脱脂牛乳相比,经蛋白酶处理后,颜色变化明显,亮度变暗;且随着酶解时间的延长,亮度继续变暗,色泽逐渐偏红、偏黄。在酶解4 h后,3 种蛋白酶水解物之间L*值无显著差异,风味蛋白酶a*值、b*值显著大于复合蛋白酶、碱性蛋白酶,说明风味蛋白酶处理对脱脂牛乳色泽影响大于碱性蛋白酶和复合蛋白酶处理。

图4 蛋白酶处理对脱脂牛乳L*、a*、b*值的影响Fig. 4 Effect of protease treatment on color parameters of skim milk

2.4 蛋白酶处理对脱脂牛乳电子舌味感值的影响

2.4.1 雷达图及相关性分析

香甜味是脱脂牛乳的主要滋味指标。如图5所示,与对照组相比,经3 种蛋白酶酶解处理的原料乳甜味值均显著下降(P<0.05),丰富度以及鲜味值也略有下降,后味B(苦味回味值)、酸味、涩味、后味A(涩味回味值)则有所上升。这主要是由于酶解促使一些苦味、涩味物质(肽、游离氨基酸)产生,且苦味、后味B(苦味回味值)与甜味之间存在味觉的消杀作用,与甜味值存在的负相关关系如表2所示。

图5 脱脂牛乳酶解产物电子舌雷达图Fig. 5 Electronic tongue radar maps of enzymatically hydrolyzed skim milk

表2 电子舌味觉值相关性分析Table 2 Correlation analysis among electronic tongue taste values

如表3所示,酶解时间对脱脂牛乳的滋味也有明显影响,其中酶解产物后味B(苦味回味值)与酶解时间呈极显著正相关,苦味与酶解时间呈显著正相关,甜味与酶解时间呈显著负相关,引起苦味值的上升,甜味值的衰退。

表3 电子舌味觉值与酶解时间相关性分析Table 3 Correlation analysis between electronic tongue taste values and enzymatic hydrolysis time

2.4.2 主成分分析

主成分分析(princpal component analysis,PCA)以散点图为基础,利用向量分析和相关矩阵的分类技术,将每个点代表1 个样品,点之间的距离代表样品之间特征差异的大小[26],可以直观地判断不同组分间的差异。为考察不同蛋白酶的酶解过程中滋味物质的差异性,实验以相同温度及时间条件,以未经酶解处理的脱脂乳为对照,对测得的滋味物质进行PCA。

由图6可知,PC1的贡献率为49.0%,PC2的贡献率为39.4%,总贡献率为88.4%,二者总贡献率超过80%[27],表明PC1和PC2可代表样品中不同蛋白酶酶解过程中滋味物质的主要特征,说明电子舌能够有效区分不同蛋白酶酶解过程中滋味物质的差异。不同蛋白酶水解物与对照组分布在不同区域,且4 组样品数据均分布在95%的置信区间内,说明3 组实验组及对照组样品,在滋味物质组成及含量上存在较大差异。对照组组内聚集性好,说明在相同温度及时间条件,原料乳滋味物质变化较稳定,且滋味物质主要以鲜甜味为主,经过酶解处理的牛乳,其组内聚集性差,可能是由于酶解的处理引起滋味物质与蛋白质之间相互作用方式发生改变,导致滋味物质变化很大。3 种蛋白酶相比,碱性、风味蛋白酶组内聚集性小于复合蛋白酶,碱性蛋白酶以涩味及涩味回味为主,风味蛋白酶以咸味、苦味及苦味回味为主。复合蛋白酶以酸味为主,苦涩等味觉较低,可能是由于不同蛋白酶的酶切位点不同,导致不同呈味物质的释放。且3 种酶解产物随着酶解时间延长,样品滋味的响应值分布呈现一定趋势,说明脱脂乳酶解产物滋味的变化与蛋白酶处理及蛋白酶种类有关系,且滋味物质会随酶解时间变化而呈现规律性变化。

图6 不同蛋白酶作用下脱脂牛乳酶解产物滋味物质PCA分析结果Fig. 6 Principal component analysis (PCA) plots for taste substances in enzymatically hydrolyzed skim milk

2.5 游离氨基酸分析

2.5.1 游离氨基酸组成及评价

游离氨基酸能够被人体直接吸收,其含量和成分能够部分反映出食品的营养价值[28]。表4~6表明,对照组及不同蛋白酶酶解产物中主要检测到16 种游离氨基酸,且与对照相比,不同蛋白酶酶解产物中总游离氨基酸(total content of free amino acids,TFAA)及必需氨基酸(essential amino acid,EAA)含量呈随酶解时间延长而持续增加的趋势。在酶解4 h时,风味蛋白酶酶解产物中TFAA含量最高为628 mg/100 mL,其次是碱性蛋白酶酶解液和复合蛋白酶,分别为289、194 mg/100 mL。风味蛋白酶组中TFAA较其他蛋白酶组高,是由于风味蛋白酶的水解度最大,因此酶解过程中释放出大量的游离氨基酸,而碱性及复合蛋白酶水解度小,释放的游离氨基酸总量也低。

表4 碱性蛋白酶酶解产物游离氨基酸含量及组成Table 4 Free amino acid composition of alkaline protease hydrolysate

表5 复合蛋白酶酶解产物游离氨基酸含量及组成Table 5 Free amino acid composition of protamex hydrolysate

对照组中谷氨酸含量最高,这与刘海燕[29]、张兰威[30]等的发现相同,谷氨酸可以为三梭酸循环中的Q-酮戊二酸提供来源[31]。碱性蛋白酶酶解产物以His、Arg、Lys、Phe、Tyr为主要氨基酸;复合蛋白酶酶解产物以Leu、Arg、Met、Phe、Tyr为主要氨基酸;风味蛋白酶酶解产物以Thr、Arg、Leu、Tyr、Phe为氨基酸。其中His促进铁吸收[32],可防止脑损伤[33],是婴儿必需的氨基酸;Arg具有抗肿瘤、调节免疫力[34-35]的功能,可通过调节蛋白的转化来刺激胎儿棕色脂肪细胞前体细胞的生长发育;Lys可提高钙的吸收及其在体内的积累,加速骨骼生长,增强免疫力,提高智力,促进发育[36-37],可直接进入脑组织,影响呼吸链,为神经细胞的修复和进行正常生理活动提供必要的能量来源;Phe在人体内能合成重要的神经递质和激素以改善人体的记忆力[38-40];Tyr具有促进黑色素形成的功能[41];Leu可以提高肌纤维尺寸的恢复,让思维更加敏捷;Met参与脂肪的减少和解毒,以及胆碱的合成,能协助脂肪分解;Thr具有增强免疫力和转变某些氨基酸达到平衡的功能[42];这些结果为促进乳制品的发展提供了数据。

表6 风味蛋白酶酶解产物游离氨基酸含量及组成Table 6 Free amino acid composition of flavourzyme hydrolysate

2.5.2 游离氨基酸呈味特征分析

游离氨基酸具有呈味阈值低、呈味能力强的特点,其含量和种类会直接影响食品的风味。由图7可知,对照组中鲜甜味呈味氨基酸占TFAA比例达80.98%,苦味呈味氨基酸占TFAA比例为18.19%。3 种蛋白酶酶解产物中鲜甜呈味氨基酸质量浓度分别为风味蛋白酶(164.557 mg/100 mL)>复合蛋白酶(28.590 mg/100 mL)>碱性蛋白酶(25.888 mg/100 mL),占氨基酸总量的比例分别为25.54%、14.70%、8.95%,酶解液中均含有鲜甜味氨基酸,而风味蛋白酶酶解液中鲜甜呈味氨基酸的质量分数最高;酶解液中苦味呈味氨基酸质量浓度分别为风味蛋白酶(446.69 mg/100 mL)>碱性蛋白酶(256.069 mg/100 mL)>复合蛋白酶(163.26 mg/100 mL),占氨基酸总量的比例分别为69.31%、89.63%、83.94%,实验结果表明脱脂乳中鲜甜味氨基酸比例较大,而酶解液中苦味占主导地位,苦味氨基酸的比例几乎是鲜甜味氨基酸的3~10 倍,这与电子舌测定结果类似,酶解处理会导致鲜甜味下降,苦涩等味上升。其中风味蛋白酶所含鲜甜味氨基酸及其所占比例最高,但其苦味氨基酸含量也极高,相比之下,复合蛋白酶苦味氨基酸含量最少,所占比例略低于风味蛋白酶,鲜甜味氨基酸比例仅次于风味蛋白酶,高于碱性蛋白酶,因此综合比较复合蛋白酶优于碱性蛋白酶和风味蛋白酶。

图7 各蛋白酶酶解液呈味氨基酸含量及百分比Fig. 7 Contents and percentages of taste-active amino acids in enzymatically hydrolyzed skim milk

进一步统计鲜味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸在酶解过程中不同酶解液占总呈味氨基酸比例的变化,首先针对鲜味氨基酸:碱性蛋白酶酶解液比例随着酶解时间的延长先减少后增加,由酶解第15 分钟的1.71%下降到第60分钟的最低值1.23%,复合蛋白酶比例呈上升趋势,风味蛋白酶比例呈先上升后下降又上升的波动趋势,但最终含量都比脱脂乳低;其次甜味氨基酸的变化情况,3 种蛋白酶解液类似,均呈上升趋势,但最终含量也均比脱脂乳低;最后针对苦味氨基酸,碱性蛋白酶比例呈减少-增加-减少-增加的波动趋势,而复合蛋白酶和风味蛋白酶比例均先增加后减少,但最终含量比原乳高,上述结果表明,虽然酶解促使体系中游离氨基酸和呈味氨基酸总体含量增加,但却更多地向苦味方向发展。

酶解液的滋味强度受呈味物质的含量和阈值共同影响[43]。如表7~9所示,碱性蛋白酶酶解液中Phe、His、Arg在180、180、60 min后的滋味活性值(taste active value,TAV)值均大于1,风味蛋白酶酶解液中His、Arg、Met在第30、120、90分钟时TAV大于1,说明在此时间段后酶解液具有较强的苦味,相比之下,复合蛋白酶组中苦味氨基酸的TAV均小于1,说明复合蛋白酶组的苦味较碱性、风味蛋白酶而言较弱。但3 种蛋白酶酶解物苦味物质在整体呈味物质TAV中占比均大于70%,这表明苦味是酶解液的主要呈味成分,因此脱苦是下一步需要解决的重要问题。

表7 碱性蛋白酶酶解产物游离氨基酸的TAVTable 7 Taste activity values of free amino acids in alkaline protease hydrolysate

表8 复合蛋白酶酶解产物游离氨基酸的TAVTable 8 Taste activity values of free amino acids in protamex hydrolysate

表9 风味蛋白酶酶解产物游离氨基酸的TAVTable 9 Taste activity values of free amino acids in flavourzyme hydrolysate

3 结 论

本实验结果表明,在不同蛋白酶及酶解时间处理会引起脱脂乳色泽、滋味等感官特性以及游离氨基酸含量的变化。与未处理的脱脂乳相比,牛乳酶解处理后的白色渐渐消失,透明度增加,色泽偏黄;通过电子舌分析,3 种酶解产物的甜味值显著下降,丰富度及鲜味值略有下降,酸、苦、涩味指标呈现上升趋势;PCA可知复合蛋白酶、碱性蛋白酶处理产物与原料乳滋味相近,优于风味蛋白酶产物;此外,酶解产物总游离氨基酸及必需氨基酸含量显著上升,His、Lys、Phe等含量增加明显,且苦味氨基酸占据主要呈味氨基酸。综上所述,酶解处理对脱脂乳感官特性会有一定程度的不利影响,但游离氨基酸含量及组成的变化会提升其营养价值。因此,实验为后续酶解技术的产品开发提供了感官及游离氨基酸方面的数据支撑和理论依据,且后续需要继续深入研究功能性营养成分、致敏性及避免色泽、滋味等品质变化的方法,进而保证产品的感官等特性达到市场接受水平,辅助功能性产品及低敏乳制品的开发,以便酶解技术及产物能更好地应用于食品工业中。

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