双金花茶对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用

王晓燕王捷

(1.广西医科大学 药学院， 广西 南宁 530021；2.广西医科大学第一附属医院 药学部， 广西 南宁 530021)

0 引言

双金花茶来源于中国广西民间习用方，遵循中华医药传统理论，结合壮医通路排毒理论，精选金花茶叶、金银花、菊花、玳玳花、茉莉花、槐花等配伍，经现代先进工艺制备的复方中药制剂，有清热解毒、平肝明目、活血理气、利湿消肿、退黄止痢功效，主治风热头痛、目赤肿痛、黄疸、痢疾等。金花茶叶，收载于广西壮族自治区壮药质量标准(第二卷)，味微苦、涩,性平，归肝、肾经，清热解毒、利尿消肿、止痢，用于咽喉疼痛、臌胀、水肿、小便不利、疮疡、泄泻、痢疾等。现代药理学发现金花茶叶抗氧化、抑菌、降血脂、降血糖等[1- 4]。金银花，味甘、性寒，归肺、胃经，清热解毒，主温病发热、热毒血痢、痈肿疔疮、喉痹等。金银花有显著抗菌消炎作用，现代誉为“植物抗生素”[5]。菊花，味苦、甘，性微寒，归肺、肝经，散风清热、平肝明目、清热解毒，主治风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花、疮痈肿毒。玳玳花，味辛甘，微苦，性平，理气宽胸、和胃止呕，主胸中痞闷、脘腹胀痛、不思饮食、恶心呕吐。茉莉花，味辛、甘，性温，理气、开郁、辟秽、和中，用于下痢腹痛、目赤红肿、疮毒。 现代药理学发现其提高免疫力、抗氧化、抗菌等[6]。槐花，味苦、性微寒，归肝、大肠经，入血敛降、凉血止血、清肝泻火，主治肠风便血、尿血、衄血、肝火头痛、目赤肿痛、痈疽疮疡等。该方诸药合用，发挥协同增效作用。现在已有基础上，观察双金花茶对重要器官肝脏的影响，采用皮下注射CCl4，造成小鼠急性肝损伤，探讨双金花茶对肝损伤的保护作用及可能的机制，为深入研究双金花茶的保肝作用及后续开发利用提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

KM小鼠50只，SPF级，雄性，体重为18.0～22.0 g。由广西医科大学实验动物中心提供，适应性饲养3 d后，随机分组进行药物处理。动物生产许可证：SCXK桂2014—0002，使用许可证：SYXK桂2014—0003。

1.2 试药

双金花茶(由项目课题组自制，批号20181019)； ALT(批号20181027);AST(批号20181017);MDA(批号20181101);SOD(批号20181030)及GSH-Px(批号20181029)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；BCA蛋白浓度剂盒购于碧云天生物技术研究所。

1.3 仪器

S10手提式高速分散器(宁波新芝生物公司);MICRO17R高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司);XS205DU电子分析天平(梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司);CX31DP73生物显微镜(奥林巴斯(中国)有限公司);TV-1901紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);SpectraMaxPlus384连续光谱扫描式酶标仪(香港分子仪器公司)。

2 方法

2.1 分组及给药

将50只雄性昆明种小鼠随机分成5组，分别为空白对照组、溶媒对照组、模型组及双金花茶低、高剂量组(2.59、10.35 g/kg)，每组10只[7]。双金花茶组按小鼠体重20 mL/kg进行灌胃，每天1次，连续14 d。空白对照组、溶媒对照组和模型组以同样方式给予蒸馏水灌胃。末次给药后，模型组和双金花茶组小鼠给予25%CCl4油溶液皮下注射10 mL/kg造成急性肝损伤，溶媒组以同样方式皮下注射等量的花生油。24 h后摘除眼球取血，颈椎脱臼处死小鼠，取其肝脏和脾脏。

2.2 血清 ALT、AST 水平的测定

摘除眼球后，分离血清，以ALT、AST水平作为急性肝损伤的生化指标。将血液盛入离心管中，静置10 min，低温离心，取上层血清。按照试剂盒说明方法测定小鼠血清中ALT、AST的含量。

2.3 肝组织 MDA、SOD 及 GSH-Px 水平的测定

采血结束后，处死小鼠，分离肝脏，制备10%的肝组织匀浆。按照试剂盒说明方法用紫外可见分光光度计测定肝匀浆中MDA、SOD、GSH-Px的含量[8]。

2.4 脏器指数计算

摘取小鼠的肝脏和脾脏，肉眼观察小鼠肝脏和脾脏的外观，立即放入生理盐水中漂洗干净后吸干血水，分别对肝、脾进行称量，计算脏器指数(脏器指数=脏器质量/体重×100%)[9]。

2.5 HE染色观察肝组织病理变化

取小鼠肝右叶组织切成块状，保存在4%多聚甲醛磷酸缓冲溶液中，嵌入石蜡，制成石蜡切片,常规HE 染色，光学显微镜下组织的病理变化[10]。

2.6 统计学分析

3 结果

3.1 双金花茶对小鼠血清ALT、AST水平的影响

双金花对CCl4所致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST水平的影响见表1。从表1结果显示，与空白对照组和溶媒对照组比较，单次给药25%CCl4可使模型组小鼠血清ALT、AST水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较，所有剂量组经过双金花茶预处理14 d后，血清ALT和AST水平明显降低。双金花茶低剂量组(2.59 g/kg)可阻止小鼠CCl4引起的血清ALT、AST升高，但差别不具统计学差异，高剂量组(10.35 g/kg)可显著降低ALT和AST水平(P<0.01)。

表1 双金花茶对CCl4所致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST水平的影响Tab.1 Effects of Shuangjinhua tea on the serum levels of ALT and AST in mice with acute liver injury induced by CCl4

3.2 双金花茶对小鼠肝组织 MDA、SOD、GSH-Px水平的影响

双金花茶对CCl4所致急性肝损伤小鼠肝匀浆 MDA、SOD、GSH-Px水平的影响见表2。从表2结果显示，模型组MDA相较于空白对照组显著提升(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性显著降低(P<0.01)。与模型组比较，双金花茶显著降低肝脏MDA水平(P<0.05，P<0.01)，可减轻肝细胞损伤的严重程度。高剂量组SOD、GSH-Px活性显著升高(P<0.01)，低剂量组小鼠SOD、GSH-Px活性具有升高趋势，但不具统计学差异，说明双金花茶在一定程度上可恢复肝脏抗氧化酶的活性。

表2 双金花茶对CCl4所致急性肝损伤小鼠肝匀浆 MDA、SOD、GSH-Px水平的影响Tab.2 Effects of Shuangjinhua tea on the levels of MDA,SOD and GSH-Px in liver homogenates of CCl4-treated mice

3.3 双金花茶对肝脾指数的影响

双金花茶对CCl4致急性肝损伤小鼠肝脾指数的影响见表3。从表3结果显示，与空白对照组比较，模型组小鼠肝脏、脾脏明显肿大，肝脾指数均显著增加(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，双金花茶肝指数有不同程度降低，其差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，低剂量组小鼠脾指数降低不具统计学差异，高剂量组脾指数显著减少(P<0.05),表明双金花茶对急性肝损伤所造成的肝脾肿大具有抑制作用。

表3 双金花茶对CCl4致急性肝损伤小鼠肝脾指数的影响Tab.3 Effect of Shuangjinhua tea on index of liver and spleen of mice with CCl4-induced acute liver injury

3.4 双金花茶对肝组织结构的影响

双金花茶对小鼠肝组织病理学的影响如图1所示。根据图1肝组织切片显示，对照组肝组织病理显示肝细胞正常；与对照组比较，单次给药25%CCl4可导致模型组小鼠肝脏结构丧失，包括空泡形成、炎性浸润和坏死；双金花茶低、高剂量与模型组比较，肝细胞空泡、肿胀明显改善，肝组织炎症反应均有不同程度的减轻，病变程度相对较低。

(a) 空白对照组

(b) 溶媒对照组

(c) 模型组

(d) 双金花茶低剂量组

(e) 双金花茶高剂量组

4 讨论

皮下注射CCl4是构建小鼠急性肝损伤模型的较为便捷的方法。当肝细胞受到CCl4破坏时，代谢过程中会产生大量高反应性的自由基，细胞膜脂质过氧化，引起膜通透性增加，从而诱发肝损伤。由于质膜破损而使一些肝细胞内的酶逸出细胞外，这些酶在血清中浓度骤然升高，其中ALT、AST能敏感地反映肝细胞损与否及损伤程度[11]。在皮下注射CCl424 h后，急性肝损伤模型得以确立，CCl4导致了小鼠的ALT和AST血清水平显著增加，肝脏和脾脏组织肿大并伴有组织病理学病变，例如肝细胞空泡变性，小叶间静脉被大量的炎性细胞浸润。双金花茶含有黄酮、多酚、多糖等活性成分，可抑制和阻止氧自由基反应，同时提高体内抗氧化酶的活性。通过双金花茶预处理14 d，抗自由基活性成分发挥作用，较好地保护机体组织不受CCl4造成的氧化侵袭，可以改善ALT和AST血清水平，缓解小鼠肝脾肿胀，对CCl4引起的小鼠肝细胞炎症和坏死具有保护作用。

CCl4诱导肝损伤时，脂质在过氧化过程中会产生脂质过氧化产物MDA，能引起肝细胞膜蛋白变性，增加细胞膜的通透性，反映了肝细胞损伤的严重程度。SOD、GSH-Px能清除氧源性自由基及前体自由基即活性氧，而减轻活性氧引起的损伤。活性氧生成过多，抗氧化系统失去平衡，SOD、GSH-Px可以阻止细胞膜结构遭到活性氧的破坏，一旦两者的活性受到了抑制，引起肝细胞损伤加剧。因此，可通过检测肝脏SOD和GSH-Px的水平，反映机体过氧化过程中清除氧自由基的能力。本实验研究证明，CCl4导致肝组织MDA水平显著增加，SOD和GSH-Px水平显著下降，表明肝细胞受到过氧化损伤。双金花茶中内含丰富的抗氧化活性成分，具有抗氧化作用和抗炎作用，保护细胞免受氧化应激。通过抑制脂质过氧化反应从而对肝脏产生保护作用，使MDA水平均明显降低，并进一步提高SOD、GSH-Px水平，增强肝细胞的抗氧化和清除氧自由基能力，减轻肝损伤程度。

综上所述，本文的研究结果初步证明了双金花茶对CCl4诱导小鼠的急性肝损伤具有有效的预防与保护作用，其作用机制可能是通过抑制细胞膜脂质过氧化和清除活性氧自由基、增强其抗氧化作用，从而预防和阻止肝损伤，其药理作用的具体分子机制仍需进一步深入研究。双金花茶对CCl4诱导的肝损伤具有显著的抗氧化和护肝活性，可开发为相应的护肝保健品。