他达拉非片的制备及体内外释放的研究

孙钦勇，冯中，张朝，杜丽平，张贵民（鲁南制药集团股份有限公司，国家手性制药工程技术研究中心，山东临沂 273400）

他达拉非（tadalafil）为环磷酸鸟苷（cGMP）特异性磷酸二酯酶5 的选择性抑制剂[1]，分子式为C22H19N3O4，分子量为389.41，是继西地那非和伐地那非的第三代临床通过抑制5 型磷酸二酯酶（PDE5）治疗勃起功能障碍（ED）的药物[2]，具有疗效好、作用持久、安全性高等优点。

他达拉非片原研厂家为美国Lilly Company，商品名为CIALIS，于2003年在FDA 批准，上市规格为2.5 mg，5 mg，10 mg 和20 mg。他达拉非属于生物药剂学（BCS）Ⅱ类[3]，即低溶解性-高渗透，在水中溶解度低影响了药物的溶出速度，导致其生物利用度低且吸收差异度大[4]，目前国内有关他达拉非片制剂工艺的研究文献较少。本研究以CIALIS 为参比制剂，通过对原研片的处方及制备工艺进行调研，对其溶出曲线、溶出率、硬度、崩解时限等指标进行测定，旨在寻找能使自制片与参比制剂性质接近的制备工艺。预试验表明，选用湿法制粒工艺制备内颗粒与外加辅料混合后压片，得到自制片与原研片溶出率和溶出相似因子略有差异，其他性质基本接近。本试验拟采用Box-Behnken 法优化配方工艺，期望提高自制片与原研片的溶出率与溶出相似因子，同时用Beagle 犬对自制片与原研片在体内的药代动力学进行评价。

1 材料

CPR-18 型 8冲旋转压片机（意大 利BONAPACE）；TMG 1/6 型混合制粒机（德国Glatt）；Quadro® Comil® U5 型锥式整粒机（IDEX Corperation，USA）；Mini/Midi-Glatt 型流化床/GC1 型包衣机（德国Glatt）；DT50 型自动崩解仪（瑞士Sotax）；UltiMate 3000 型高效液相色谱仪（美国Thermo）；System 860DL 型溶出仪（美国Logan）；HDT-400C 硬度仪（美国Logan）；TSQ Quantum UltraAM 型LC-MS/MS 联用仪（美国 Thermo Finnigan）；Milli-Q 超纯水机（美国Millipore 公司）；Spiral Jet Mill MC44 型气流粉碎机（昆山优纳克机械有限公司）。

他达拉非片（商品名CIALIS）（参比制剂，Lilly USA，规格：20 mg，批号：C931765A）；他达拉非原料药（山东新时代药业有限公司，含量：99.9%，批号：20191001）；（6S，12aS）-tadalafil 对照品（含量：99.8%，批号：16121401）、地西泮对照品（含量：99.9%，批号：181116-201903）（上海特化医药科技公司）；一水乳糖（DFE，批号：104BX94）；羟丙基纤维素（Nippon soda，批号：NID-0831）；十二烷基硫酸钠（BASF，批号：5190200001966）；微晶纤维素（MingTai，批号：5190800005267）；羧甲基纤维素钠（JRS，批号：32010183144）；硬脂酸镁（Peter Greven，批号：518022299）；欧巴代（卡乐康，批号：H20170700）；正己烷、异丙醇、甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

Beagle 犬，雄性，体质量（6.5±0.5）kg [北京玛斯生物技术有限公司，实验动物生产许可证号SYXK（鲁）20180007]。动物饲养于山东新时代药业药理中心，饲养环境温度（22±4）℃，湿度35%～75%，12 h/12 h 交替照明。动物给药前禁食过夜（12 h），可自由饮水。所有动物实验符合实验室动物饲养和使用指导原则，取血在山东新时代药业药理中心完成。

2 方法与结果

2.1 他达拉非片的制备

称取一水乳糖245.00 g、羟丙基纤维素8.23 g、十二烷基硫酸钠1.00 g 分别过40 目筛后与他达拉非原料药20.00 g [粒径为5 μm（D90）]，充分混匀，湿法制备内颗粒，流化床干燥，所得颗粒与微晶纤维素52.50 g、羧甲基纤维素钠22.40 g 混合均匀，加入过80 目筛的硬脂酸镁0.87 g，混合5 min，压片，目标片重350 mg，目标硬度90～110 N，10%欧巴代溶液包衣增重3%即得。

2.2 他达拉非含量测定

2.2.1 对照品溶液的配制 精密称取（6S，12aS）-tadalafil 对照品适量，加正己烷∶异丙醇∶乙腈＝40∶40∶20（V/V/V）溶解，稀释制成0.25 mg·mL－1的溶液。

2.2.2 供试品溶液的配制 取他达拉非参比制剂两片，用研钵研碎后精密称取粉末约45 mg，加正己烷∶异丙醇∶乙腈＝40∶40∶20（V/V/V）溶解，稀释制成0.25 mg·mL－1的溶液。

2.2.3 色谱条件 色谱柱HiChrom Partisil SCX（250 mm×4.60 mm，5 µm），流动相为正己烷∶异丙醇＝50∶50（V/V）；检测波长285 nm；流速1.0 mL·min－1；柱温35℃；进样量10 µL[5-6]。

本色谱条件下他达拉非质量浓度（C）在0.025～0.500 mg·mL－1内与峰面积（A）线性关系良好，回归方程为A＝1.963×104C＋20.13，r＝0.9998。取供试品溶液（0.26 mg·mL－1）分别 在0、2、4、6、8、12、24、48 h 取样，测得样品的RSD为1.6%，表明该方法的稳定性良好。高、中、低浓度的平均加样回收率（n＝3）分别为99.8%、99.5%和98.6%，RSD值分别为0.45%、0.62%和0.97%，表明该方法准确度和精密度良好。

2.2.4 他达拉非溶出方法 采用 FDA 溶出度数据库推荐的溶出测定装置Ⅱ（桨法），选用0.5% SDS 溶液 1000 mL 作为溶出介质，温度为（37±0.5）℃，转速为50 r·min－1，分别于5、10、20、30、45 min 取样测定含量[7]。

2.2.5 基础处方的质量评价结果 照“2.1”项下处方和工艺制备他达拉非自制片，并照上述方法进行溶出率与溶出曲线相似因子的测定，自制片与参比制剂的f2为48.9；溶出率为参比制剂的（87.4±3.9）%，结果表明，该基础处方工艺不能初步满足他达拉非片溶出的要求，需进一步优化。

2.3 效应面法优化溶出率

经处方分析，一水乳糖为填充剂，占比较大，对物料的流动性、混合均匀度、片剂成型、崩解时限以及溶出等都具有显著影响，羟丙基纤维素是常用的崩解剂，其用量影响片剂的崩解，因一水乳糖与羟丙基纤维素的比例影响药物的崩解与溶出，将其作为重点考察，确立为因素A；他达拉非为BCSⅡ类，原料药粒径会改变药物的溶解性，因此将原料药的粒径（D90，μm）确立为因素B；十二烷基硫酸钠分子结构中含有烷基，能增加他达拉非的溶出，将其百分量占比作为因素C。在进行溶出度检测时，20 min 时自制片与参比制剂溶出率差异最大，作为相似因子的评价指标；45 min 时参比制剂溶出率达97%，选择45 min 考察最终溶出率；定义相似因子与溶出率的综合评价指标为Y，Y＝Y20＋1.25Y45（Y20、Y45为自制片与参比制剂20 min、45 min 溶出率差的绝对值，Y20约为Y45的1.25 倍，进行1.25 倍的加权修正）。

星点设计因素水平表和试验结果见表1和表2，运用Design-Expert 8.06 软件对试验结果进行拟合和分析。按“2.1”项下工艺制备片剂，按“2.2.4”项下方法检测溶出。

表1 BBD 设计因素水平表Tab 1 Factors and levels for BBD design

表2 各因素对片剂溶出率的影响Tab 2 Effect of various factors on dissolution

使用Design-Expert 8.0.6 对溶出率试验结果（Y）进行多元回归分析，所得回归方程拟合Y＝90.07－3.90A＋1.53B－107.16C－0.11AC－0.23BC＋0.066A2＋0.21B2＋206.55C2，R2＝0.9895，二项式模型拟合的P值为0.0001（P＜0.05），表明精密度良好，模型能较好地预测试验结果，能应用于自制片的处方筛选试验。

根据上述方程绘制自变量A、B、C对评价指标Y的等高线和效应面，见图1，由图可知，因素A、B、C相互之间均具有较为明显的交互作用，根据设计的评价指标应选择区域最低点为目标值，此效应面有较优区域，其中对Y影响最大的为一水乳糖与羟丙基纤维素的比例，其次为原料药的粒径分布。片剂崩解行为根据Design-Expert 8.06 软件推荐的处方并结合片剂制备的实际情况，确定单片处方中一水乳糖∶羟丙基纤维素为30∶1，原料药粒径为4.5 μm，十二烷基硫酸钠用量为0.26%。

图1 Y 的三维响应面图Fig 1 Three-dimensional response surface plots of Y

2.4 处方验证

采用优化后的处方，称取一水乳糖735.5 g、羟丙基纤维素24.51 g、十二烷基硫酸钠2.730 g分别过40 目筛后与他达拉非原料药60.00 g（粒径为4.5 μm）充分混匀制备内颗粒，加入微晶纤维素157.5 g，羧甲基纤维素钠67.20 g，混合均匀后加入过80 目筛的硬脂酸镁2.630 g，混合均匀后压片，控制片重为350 mg 压片，10%欧巴代溶液包衣增重至片重的3%即得。自制批量为3000 片的3 批他达拉非片，所得制品为暗黄色、光滑杏仁状药片，他达拉非片的基本参数见表3。

表3 他达拉非自制片物理性质及其含量Tab 3 Physical properties and content of self-made tadalafil tablets

按照“2.2.4”项下溶出方法测定3 批自制片和参比制剂（C931765A）在0.5% SDS 溶液的溶出曲线（n＝6）见图2，最终溶出率差异见表4，溶出度相似因子f2见表5，可认为自制片与参比制剂在4 种溶出介质中体外溶出行为相似。

图2 不同介质中体外溶出曲线对比Fig 2 Dissolution profiles in different media

表4 参比制剂与3 批自制片在不同介质中的溶出率(%)Tab 4 Dissolution curve of 3 batches of self-made tablets and reference listed drug in different media (%)

表5 3 批自制片和参比制剂在不同介质中溶出曲线相似性f2Tab 5 f2 of 3 batches of self-made tablets and reference listed drug in different media

2.5 体内药代动力学

2.5.1 色谱条件 色谱柱Welch Ultimate XB-C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇∶10 mmol·L－1乙酸铵（含0.1%甲酸）＝95∶5；流速：0.3 mL·min－1；柱温：40 ℃；样品盘温度：4 ℃；进样量：10 µL。

2.5.2 质谱条件 离子源：ESI；离子检测方式：MRM；离子极性：正离子；毛细管电压：3.2 kV；离子源温度：110℃；脱溶剂温度：350℃；锥孔气：65 L·h－1；脱溶剂气：680 L·h－1；正离子方式检测，扫描方式为选择反应监测（MRM），用于定量的离子分别为他达拉非[M＋H]＋m/z：母离子390.4，子离子268.2，碰撞电压CV 40 V，碰撞能CE 22 V；内标地西泮[M＋H]＋m/z：母离子285.3，子离子 154.2，碰撞电压40 V，碰撞能CE 30 V。

2.5.3 内标溶液的配制 精确称量10.03 mg 的地西泮对照品置10 mL 棕色量瓶中，甲醇溶解、稀释定容至刻度线，制备成1000 μg·mL－1的内标地西泮储备液，取适量储备液用甲醇稀释至200 ng·mL－1即得。

2.5.4 血浆样品的处理 精密移取血浆200 μL，加入20 μL 地西泮对照品溶液（200 ng·mL－1）置20 mL EP 管中，涡旋混匀30 s，加入3 mL 提取剂（乙醚∶二氯甲烷＝70∶30），涡旋混匀3 min，3000 r·min－1离心10 min，取有机层2.4 mL，40℃、N2吹干，用200 μL 流动相复溶，4℃、10 000 r·min－1离心10 min，取150 μL 于进样瓶中，进样量10 μL。

2.5.5 方法学考察 他达拉非质量浓度（C）在1.0～2000 ng·mL－1内与峰面积（Y）线性关系良好，回归方程Y＝0.007 82C＋0.001 99，R2＝0.9969；建立比格犬血浆浓度的含量测定方法，结果表明，在蒸馏水和血浆中分别加入内标和他达拉非10、100、1000 ng·mL－1，测得的基质效应在83.51%～90.32%，说明血浆对他达拉非的测定无干扰；日内和日间精密度分别在3.4%～8.1%和2.8%～8.9%，日内和日间准确度在1.4%～4.1%和0.3%～4.5%；他达拉非回收率在86.71%～97.51%，内标回收率91.28%；样品在－20℃放置7 d，反复冻融3 次期间测得的样品的含量在98.31～103.54%，表明本法可准确测定Beagle 犬血浆中他达拉非的含量。

2.5.6 药动学方案及样品处理 采用单剂量双周期交叉试验方案[7-8]，14 只雄性Beagle 犬，随机分成两组（A 组和B 组），洗净期为一周。对Beagle 犬称重，试验前禁食12 h，空腹分别给予A、B 组他达拉非自制片和参比制剂20 mg，给药前与给药后0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、8.0、16.0、24.0、36.0、48.0 h 于前肢或后肢静脉取血约4 mL，置于肝素钠采血管中，3500 r·min－1离心10 min，取上清样品置于2 mL 离心管中，置于－20℃冰箱中冷冻保存。

2.5.7 药动学试验结果 按照“2.5.4”项下方法处理血液样本，通过色谱分析并计算，绘制平均血药浓度-时间曲线，结果见图3。采用DAS 2.0软件，利用非房室模型进行拟合[9-10]，主要药动学参数见表6。

图3 他达拉非自制片和参比制剂CIAIS 的平均药-时曲线Fig 3 Average plasma concentration-time curve of tadalafil tablets and CIAIS

表6 Beagle 犬口服自制片和CIAIS 片后的主要药动学参数(±s，n＝14)Tab 6 Main pharmacokinetic parameters of self-made and CIAIS of Beagle dogs after an oral administration (±s，n＝14)

表6 Beagle 犬口服自制片和CIAIS 片后的主要药动学参数(±s，n＝14)Tab 6 Main pharmacokinetic parameters of self-made and CIAIS of Beagle dogs after an oral administration (±s，n＝14)

Vz/F/（L·kg－1）自制片 750.80±106.23 773.24±109.22 1.86±0.23 100.24±10.20 9.48±1.70 0.026±0.004 0.38±0.08 CIAIS 片（参比制剂） 783.51±100.29 823.34±115.35 1.71±0.26 102.36±7.32 11.33±1.50 0.025±0.003 0.40±0.05制剂 AUC0～t /（ng·h·mL－1）（ng·h·mL－1） tmax/h Cmax/AUC0～∞/（ng·mL－1） t1/2/h CLz/F/（L·h·kg－1）

由表6可知，自制片Cmax、tmax与参比制剂CIAIS 基本一致。参比制剂和自制片的AUC0～t、AUC0～∞、Cmax经对数转换后进行方差分析，两种制剂上述的参数无显著性差异（P＞0.05）。经双侧t检验及（1－2α）%置信区间（CI）法计算得自制片AUC0～t、AUC0～∞、Cmax的 90%CI分别为参比制剂相应参数的87.8%～104.2%、86.3%～102.2%、91.6%～104.2%，均在80%～125%，说明两者的AUC0～t、AUC0～∞、Cmax等效。采用 Wilcoxon 检验比较两种制剂的tmax，结果显示两者tmax无显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

一水乳糖作为填充剂和黏合剂能增加药片的耐磨性，加快崩解；羟丙基纤维素为赋形剂、崩解剂，增加药片的成形性，通过响应面法优化两者配比；他达拉非水溶性较差，气流粉碎后能增加药物的相对比表面积，增加药物的溶解性，提高药物的溶出速率；十二烷基硫酸钠是一种表面活性剂，能减少压片过程中出现的黏冲、脱片等现象，能显著改善难溶性药物的溶出[11]，因此采用BBD 设计法对这3 种因素进行考察。BBD 设计是目前最常用的优化实验方案的方法之一，在各个学科领域均发挥着重要作用[12]，通过对一水乳糖与羟丙基纤维素的比例，原料药粒径以及十二烷基硫酸钠的用量进行优化，最终确定处方中一水乳糖∶羟丙基纤维素为30∶1，原料药粒径4.5 μm，十二烷基硫酸钠用量为0.26%时与参比制剂有较好的相似性。

随着药物粒径的减小，比表面积增大，孔隙率增加，吸附性增强，溶解性增强[13]，生物利用度增高，但他达拉非原料随着粒径的增大，溶出率和相似因子先增大后减小，主要原因可能为药物粒径减小到一定程度，药物表面光滑[14]，不易被润湿。随着十二烷基硫酸钠比例的增高，药物溶出率增高（Y45），20 min 时自制片与参比制剂溶出的绝对值在增大，不利于他达拉非与参比制剂溶出相似因子的改善，此可能为Y值随十二烷基硫酸钠用量增加先增大后减小的主要原因。

通常体外相关性较高，则体外释放条件越能模拟人体内的环境[15]，自制他达拉非片体外溶出曲线与参比制剂相似性较好，Beagle 犬体内药时曲线与参比制剂相关性都较高，所以此处方可进行进一步用于人体等效性实验。本实验的药动学方法，可为他达拉非在临床上生物等效实验提供指导。