正交试验设计优选利湿通淋颗粒的醇提工艺研究

袁敏（山东省中医药研究院，济南 250014）

利湿通淋颗粒由黄柏、蒲公英、苦地丁、金钱草、绵萆薢、石韦、益母草、王不留行、皂角刺、川牛膝10 味中药组成，是在经典方五味消毒饮、滋肾通关丸及程式萆薢消毒饮的基础上，结合多年的临床经验化裁而来，具有清热利湿、散结通淋之功效[1]，为治疗湿热瘀阻型慢性前列腺炎的有效方剂。针对方中各药材的理化性质及药理作用[2-6]，为使各药的主要有效成分尽可能多地被提取出来，更好地发挥药效，对方中黄柏、石韦、王不留行、皂角刺、川牛膝5 味中药饮片进行醇提，蒲公英、益母草、苦地丁、金钱草、绵萆薢5 味中药饮片进行水煎煮提取（工艺筛选另文发表）。黄柏是清下焦湿热的佳品，具有清虚热、解疮毒作用，含有多种生物碱成分，其主要成分为小檗碱，研究表明小檗碱可通过诱导周期停滞和细胞凋亡来抑制前列腺癌细胞的生长[2]。本文以君药黄柏中小檗碱转移率和醇提物干膏得率为评价指标[7]，采用单因素考察及L9（34）正交试验设计对方中醇提药材进行工艺优选，为利湿通淋颗粒的深入研究与开发提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695-2998 高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Diamonsil C18柱（北京迪科马科科技有限公司）；十万分子一电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，型号：BT125D]；超声波双频清洗机（宁波新芝生物科技有限公司，型号：SB5200DTS）。

1.2 试药

盐酸小檗碱对照品（批号：0713-9906，供含量测定用，中国食品药品检定研究院）；饮片均购自山东百味堂中药饮片有限公司，经中药资源研究室林慧彬研究员鉴定为2015年版《中国药典》收载的正品；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每100 mL 加十二烷基硫酸钠0.1 g）；流速：1 mL·min－1；检测波长265 nm；进样量：10 μL；柱温：30℃。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加流动相溶解，定容，制得质量浓度为0.108 mg·mL－1的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

按处方比例称取黄柏4 g、石韦4 g、王不留行4 g、皂角刺3 g、川牛膝2 g，分别加60%乙醇为饮片总重的10 倍、8 倍、8 倍量，提取3 次，每次1.0 h，合并提取液，120 目滤布过滤，置于500 mL 量瓶内，冷却至室温，加60%的乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，精密移取样品溶液10 mL，置于蒸发皿中，蒸干，用流动相溶解并转移至50 mL 量瓶中，加流动相适量，超声处理（250 W，40 kHz）40 min，放至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4 黄柏药材溶液的制备

取黄柏饮片粉末（过三号筛）约0.1 g，精密称定，置100 mL 量瓶中，加流动相80 mL，超声处理（250 W，40 kHz）40 min，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得[1]。

2.5 干膏得率的测定

精密移取“2.3”项下样品溶液25 mL，水浴蒸干，残渣于105 ℃干燥3 h，取出，置于干燥器中，放冷至室温，精密称定，根据减失的重量，计算干膏得率（%）。

2.6 缺黄柏阴性样品溶液的制备

按照处方比例称取缺黄柏的其他4 味饮片，按照“2.3”项下方法处理，制得缺黄柏阴性样品溶液。

2.7 专属性试验

分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液、缺黄柏阴性样品溶液各10 μL，进样测定。结果在与对照品溶液相同的保留时间处，阴性样品溶液未出现相应吸收峰，表明该方法无干扰、专属性好。结果见图1。

图1 盐酸小檗碱对照品（A）、供试品（B）、缺黄柏阴性样品溶液（C）HPLC 色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of berberine hydrochloride（A），sample（B），and negative sample without Phellodendri（C）

2.8 方法学考察

2.8.1 线性关系考察 按“2.2”项下方法配制并稀释制得质量浓度为0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 mg·mL－1的小檗碱系列对照品溶液。按照“2.1”项下色谱条件进样测定。以进样量（µg）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y＝4.37×106X－3.13×105（r＝0.9999），表明盐酸小檗碱在0.40～2.40 μg与峰面积呈良好的线性关系。

2.8.2 精密度试验 精密吸取“2.2”项下对照品溶液10 μL，连续进样6 次，测定峰面积值，得RSD为0.31%，表明仪器精密度良好。

2.8.3 稳定性试验 精密吸取“2.3”项下供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 时进样测定峰面积值，得RSD为1.3%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.8.4 重复性试验 按“2.3”项下方法平行制备样品溶液6 份，分别进样测定，结果小檗碱的平均含量为51.43 mg·g－1，RSD为1.2%，表明该方法重复性良好。

2.8.5 加样回收试验 精密移取“2.3”项下样品溶液5 mL，置于蒸发皿中，蒸干，用流动相转移至 50 mL量瓶中，精密加入质量浓度为0.40 mg·mL－1的盐酸小檗碱对照品溶液5 mL，按照“2.3”项下方法平行操作6 份，分别进样10 μL，计算得小檗碱的加样回收率在97.84%～100.4%，RSD为2.1%（n＝6）。

2.9 单因素考察

分别以50%、60%、70%、80%和 90%的乙醇为提取溶剂，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定。以小檗碱转移率和干膏得率为主要评价指标，权重系数按小檗碱转移率（小檗碱转移率%＝利湿通淋颗粒中小檗碱的含量/黄柏药材中小檗碱的含量×100%）和干膏得率分别占比60%、40%来计算综合评分，Y＝X1/X1max×60%×100＋X2/X2max×40%×100，以综合评分值（Y）对试验结果进行分析[8]。由试验结果可知，60%的乙醇溶液作提取溶剂时，所得小檗碱转移率和干膏得率的综合评分最高，因此，选用60%的乙醇溶液作为提取溶剂。

2.10 正交试验研究

2.10.1 因素与水平 根据单因素试验结果，以60%的乙醇溶液作提取溶剂，以60%的乙醇用量、提取次数、提取时间为考察因素，每个因素考察3 个水平，选用 L9（34）正交试验表安排试验[9]，因素水平见表1。

表1 因素及水平Tab 1 Factor and level

2.10.2 方法与结果 按处方比例称取各药材饮片，按照正交试验表安排试验，结果见表2、3。

表2 正交试验及结果Tab 2 Orthogonal test

表3 方差分析结果Tab 3 Variance analysis

直观分析结果表明，各因素对5 味饮片提取的影响程度依次为B＞A＞C，即提取次数＞乙醇用量＞提取时间。方差分析结果显示，因素B对小檗碱的转移率具有显著影响（P＜0.01），因素A 与因素C 对其不具有显著影响。综合直观和方差分析结果，从节能、节时及降低成本方面综合考虑，确定最佳提取工艺为A3B3C1，即以60%的乙醇溶液为提取溶剂，溶液用量分别为饮片总重的10 倍、8 倍、8 倍量，提取3 次，每次提取1.0 h。

2.10.3 验证试验 按处方比例称取5 味饮片，平行操作3 份，按照确定的最佳醇提工艺进行试验，计算小檗碱转移率。结果显示，小檗碱转移率分别 为48.82%、47.93%、49.24%，RSD为1.4%，干膏得率分别为17.42%、17.13%、17.76%，RSD为1.8%。表明该醇提工艺稳定可行，重复性良好。

3 讨论

加权评分法进行处方工艺的优选时，权重系数的赋予是综合评分标准是否科学、合理的直接体现。浸膏作为中药治疗疾病的物质基础，在遵循中医药理论和确保药效的基础上，结合本处方中药物有效成分，以黄柏中所含有效成分小檗碱的转移率和醇提物出膏率的综合评分为评价指标，权重系数分别为0.6、0.4，在单因素试验结果的基础上，采用正交试验法对利湿通淋颗粒的醇提工艺进行了优选，从而确保制剂提取工艺的科学性和准确性[10]。

本制剂组方有10 味药材组成，黄柏作为君药，在提取工艺筛选过程中，课题组曾将黄柏按照处方比例和石韦等其余4 味中药饮片混合，以60%的乙醇溶液作提取溶剂，又将黄柏按照处方比例和组方中蒲公英、益母草等其余5 味药材一起水煎煮提取，以同样的提取溶剂倍数、提取时间、提取次数，制备样品溶液和供试品溶液，经高效液相色谱测定，并计算，水煎煮提取的黄柏中小檗碱转移率为14.56%，远远小于60%的乙醇溶液提取的小檗碱转移率48.66%，故将黄柏列入醇提药材[11-13]。