高效液相色谱法测定口服液体制剂中12种添加剂的含量

辜慧，李道霞，何成军，杜钢（四川省食品检验研究院，成都 611731）

口服液体制剂易被微生物污染而发霉变质，为保障该类制剂临床用药安全，需添加适量的防腐剂，抑制微生物的生长繁殖，达到有效的防腐目的。另外，还需添加适量甜味剂及色素，改善制剂口感及外观，提高患者依从性[1]。然而，添加剂的超范围使用、过量添加会对人体造成一定的伤害。人工合成色素、甜味剂和防腐剂在市场上已有滥用的趋势，给药品安全带来了隐患，对消费者的健康造成了直接的威胁。目前，国内口服液体制剂生产企业众多，所加添加剂的种类与浓度亦各不相同，关于添加剂的测定方法文献均有报道[2-7]，未见有同时测定人工合成色素、甜味剂和防腐剂的方法报道。为了提高检验效率，节约成本，更全面地控制口服液体制剂的安全性，本研究建立了一种同时测定口服液体制剂中12种添加剂的高效液相色谱（HPLC）法。

1 仪器与试药

LC-20AT 型高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器（日本SHIMADZU 公司）；ME204 分析天平（十万分之一，瑞士METTLER TOLEDO 公司）；FB15065 超声波发生器（美国Fisher 公司）；Milli-Q 型高纯水发生器（美国Millipore 公司）；苯甲酸（批号：B0001649，浓度：1000 μg·mL－1）、山梨酸（批号：B0002741，浓度：1000 μg·mL－1）、酸性红（批号：C0005676，纯度：90.7%）、脱氢乙酸（批号：B0003452，纯度：99.9%）、糖精钠（批号：B0001955，浓度：1000 μg·mL－1）（BePure）；柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、诱惑红及亮蓝（A CHEMTEK INC，批号：S027451，浓度：1000 μg·mL－1）；甲醇、乙酸铵（色谱纯，美国Fisher 公司）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.8 mL·min－1；柱温：35℃；检测波长：230 nm；进样体积：10 μL；流动相A 为20 mmol·L－1乙酸铵溶液，流动相B 为甲醇，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序表Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取酸性红、脱氢乙酸对照品约10 mg，分别置10 mL 量瓶中，用水超声溶解并定容至刻度，摇匀，分别作为酸性红对照品储备液、脱氢乙酸对照品储备液。其余组份对照品储备液均从对照品公司购得。再分别精密量取各对照品储备液1 mL，置同一50 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 以布洛芬混悬液为例，精密量取样品1 mL，置10 mL 量瓶中，加水适量，超声处理10 min，再加水定容至刻度，摇匀，经0.45 μm 滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液 取阴性样品（蛋白酶合剂）按“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液，备用。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 分别量取“2.2”项下的空白溶剂（水）、混合对照品溶液、阴性样品溶液、供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样10 µL，记录色谱图，见图1。结果色谱图基线稳定，峰形对称，分离度较好，各峰保留时间适中，能够满足检测需要，说明本试验的专属性良好。

图1 典型HPLC 色谱图Fig 1 Typical chromatogram by HPLC

2.3.2 线性关系考察 分别精密量取不同体积的各对照品储备液，加水稀释成质量浓度分别为0.5、1、2、5、10、20 μg·mL－1的混合对照品溶液，精密吸取10 μL 注入液相色谱仪，以各组分的峰面积Y为纵坐标，进样质量浓度X（μg·mL－1）为横坐标，绘制标准曲线，结果见表2。

2.3.3 检测限及定量限考察 取混合对照品溶液，逐级稀释成系列质量浓度，分别进样10 μL，当峰高为基线噪音的3 和10 倍量时，测得各添加剂的检测限及定量限，结果见表2。

表2 12 种添加剂的回归方程、相关系数、线性范围、检测限与定量限Tab 2 Regression equation，correlation coefficient，linearity，LOD and LOQ for 12 additives

2.3.4 精密度考察 取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件下连续进样6 次，苯甲酸等12 种添加剂峰面积的RSD为0.11%～0.85%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.3.5 重复性考察 取一批样品（检出柠檬黄、苋菜红、胭脂红），按“2.2.2”项下方法前处理，平行制备6 份，按“2.1”项下色谱条件检测，计算得样品中柠檬黄平均含量为0.52 μg·mL－1，苋菜红平均含量为3.11 μg·mL－1，胭脂红平均含量为5.88 μg·mL－1，RSD分别为1.8%、1.4%、0.99%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.3.6 回收试验 以未检出添加剂的阴性样品为基质，按低、中、高浓度分别精密加入混合对照品溶液（质量浓度为20 μg·mL－1）0.5、1.0、5.0 mL，按“2.2.2”项下方法处理，制备约相当于1、2、5 μg·mL－1的回收试验溶液，每个浓度平行制备6 份。按“2.1”项下色谱条件下进行检测，并计算回收率及RSD，结果见表3。

表3 12 种添加剂的平均回收率(n＝6)Tab 3 Average recovery of 12 additives (n＝6)

2.3.7 稳定性试验 取回收试验中的低、中、高浓度的溶液，室温放置，分别于0、6、12、24、48 h 进样，各组分峰面积的RSD均小于2.0%，表明12 种添加剂在48 h 内均稳定。

2.3.8 样品测定 取10 批抽检的口服液体制剂，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件测定，结果见表4。

表4 口服液体制剂中检测出的各成分含量测定结果(μg·mL－1，n＝3)Tab 4 Content determination of various constituent in oral liquid preparations (μg·mL－1，n＝3)

3 讨论

3.1 流动相的选择

液相色谱方法测定目标化合物时，多在流动相中加入缓冲盐，试验通过优化流动相梯度洗脱程序获得合适的保留时间、峰形以及分离效果。本试验参考文献[8-10]，流动相选择乙酸铵溶液-甲醇系统，考察了流动相中乙酸铵的质量浓度分别为10、20、50 mmol·L－1时对12 种添加剂色谱行为的影响。结果表明乙酸铵质量浓度为20 mmol·L－1时，12 种添加剂的色谱峰峰形尖锐，分离度较好。故最终选择流动相为20 mmol·L－1乙酸铵溶液-甲醇体系，该流动相体系也可在检出添加剂后，直接用于LC-MS/MS 作进一步分析确认。

3.2 检测波长的确认

利用二极管阵列检测器对苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸、柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、酸性红、诱惑红及亮蓝分别进行波长扫描。其中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸最大吸收波长均在紫外光区，柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、酸性红、诱惑红及亮蓝虽然最大吸收波长均在可见光区，但紫外光区也有较强吸收。综合分析12 个标准物质的吸收曲线，各组分在 220～240 nm 均有较强吸收，故选择230 nm 作为检测波长，在此波长下基线平稳、噪声小，各组分均具有较高灵敏度。

3.3 色谱柱的选择

本文参考文献[10-12]，考察了色谱柱Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）、Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）对目标化合物分离度及峰形的影响，最终选择 Waters XBridge C18色谱柱，结果12 个目标化合物可以达到分离测定的要求，且准确可靠、重复性好。

3.4 其他

本试验采用HPLC 法同时测定口服液体制剂中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸、柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、酸性红、诱惑红及亮蓝的含量，该方法操作简便、精密度好、回收率高，能满足检测要求，适用于口服液体制剂中人工合成色素、甜味剂和防腐剂的检查。结果发现目前国内一些药品中仍存在着添加剂滥用的现象，存在较大的安全隐患，需要进行严格监管。