溃疡油高效液相色谱特征图谱研究及5种成分的含量测定

韩锋，肖宏华*，胡妍文，马秉智，刘开玉（.北京市朝阳区食品药品安全监控中心，北京 004；.中日友好医院，北京 0009）

溃疡油为中药复方制剂，处方由大黄、白芷、川芎组成，临床用于热毒蕴结于肌肤所致的疥疮、溃疡等症，具有活血生肌、消肿止痛的功能。现行质量标准[1-3]，通过薄层色谱法进行定性鉴别，样品用量大，提取方法较为繁琐。目前，针对该制剂质量分析方法的研究报道较少，为更好地控制产品质量，本文参考相关文献[4-6]，采用HPLC-DAD 法建立溃疡油的特征图谱，对该制剂所含多种化学成分进行分析，并对其中欧前胡素、藁本内酯、异欧前胡素、大黄素、大黄酚的含量进行测定，为其质量评价及控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪（Agilent 1260，DAD 检测器，二元泵，ChemStation 工作站）；电子天平（XS-205 DU，十万分之一，METTLER-TOLEDO）；纯水/超纯水系统（明澈TM-D 24 UV，Merck Millipore）；超声波清洗器（KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

药材大黄（批号：121249-201304）、川芎（批号：120918-201612）、白芷（批号：120945-201510）（中国食品药品检定研究院），对照品欧前胡素（批号：110826-201918，含量以99.0%计）、藁本内酯（批号：111737-201608，含量以86.9%计）、异欧前胡素（批号：110827-201611，含量以99.4%计）、大黄素（批号：110756-201512，含量以98.7%计）、大黄酚（批号：110796-201922，含量以99.4%计）（中国食品药品检定研究院）；甲醇（HPLC，Fisher Chemical）；磷酸（HPLC，天津市致远化学试剂有限公司）；超纯水（自制）；花生油（批号：20190923，嘉里粮油青岛有限公司）。

按溃疡油质量标准收载的处方与制法制备10 批样品，处方中大黄、白芷、川芎各10 批均为市售，经本中心肖宏华副主任药师鉴定，符合《中国药典》2015年版一部的要求。市售溃疡油5 批（厂家A：20180403、20191205、20200324、20200401；厂家B：20200106）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters XBridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；甲醇（A）、0.2%磷酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～15 min，60%A；15～25 min，60%～100%A；25～37 min，100%A）；检测波长254 nm；光谱范围：190～400 nm，流速1.0 mL·min－1；步进值1.0 nm；柱温40℃；进样量10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 取欧前胡素、藁本内酯、异欧前胡素、大黄素、大黄酚对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 分别含欧前胡素51.09 µg、藁本内酯82.90 µg、异欧前胡素10.30µg、大黄素10.56 µg、大黄酚21.35 µg 的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取溃疡油样品，精密称取2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定重量，超声处理（500 W，40 kHz）20 min，放冷至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，－18℃冷藏2 h，取上清液用0.45 µm 滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 药材及阴性样品溶液 按照溃疡油处方及工艺，制备大黄、白芷、川芎药材及相应的阴性样品，以及花生油阴性样品，并按“2.2.2”项下方法制备相应阴性样品溶液。

2.3 溃疡油HPLC 特征图谱研究

2.3.1 精密度试验 取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6 次。以峰6（欧前胡素）为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD为0.020%～0.080%，相对峰面积的RSD为0.15%～1.7%，相似度均大于0.99，结果表明该检测系统具有良好的精密度。

2.3.2 重复性试验 取同一溃疡油样品，按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以峰6（欧前胡素）为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD为0.020%～0.11%，相对峰面积的RSD为0.32%～1.7%，相似度均大于0.99，结果表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、24 h 按“2.1”项下色谱条件进行测定，以峰6（欧前胡素）为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD为0.020%～0.23%，相对峰面积的RSD为0.18%～1.6%，相似度均大于0.99，结果表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.3.4 特征图谱的建立 取10 批溃疡油，分别进行HPLC 检测，将得到的色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012 版”进行数据分析，计算相似度，建立对照图谱，见图1和图2。结果显示各批图谱与对照图谱之间相似度均大于0.94，见表1。并确定13 个共有峰，其中峰6（欧前胡素）分离度良好，保留时间和峰面积适中，且其相对稳定，故选定峰6（欧前胡素）为参照峰（S）。

图1 对照HPLC 特征图谱Fig 1 HPLC chromatogram of reference

图2 10 批溃疡油HPLC 图谱Fig 2 HPLC chromatogram of 10 batches of Kuiyang oil

表1 10 批溃疡油相似度分析结果Tab 1 Similarity of 10 batches of Kuiyang oil

2.3.5 特征峰的药味归属 取“2.2.3”项下大黄、白芷、川芎药材溶液及相应的阴性样品溶液，进行HPLC 检测，通过色谱峰保留时间及DAD 光谱图对溃疡油样品色谱中的特征峰进行药味归属，利用对照品进行成分确认。结果峰1 来源于辅料花生油，峰2、3、6（欧前胡素）、8、10（异欧前胡素）来源于白芷，峰4、7（藁本内酯）、9来源于川芎，峰5、11（大黄素）、12（大黄酚）、13 来源于大黄，见图3。

2.3.6 样品测定 取市售溃疡油5 批进行检测，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”进行数据分析，并通过与特征峰的相对保留时间和光谱图比对，除20180403 样品（其中2、3、4、7、13 色谱峰低于检出限）外，各批色谱数据与对照特征图谱的相似度在0.85 以上，均检出与对照特征图谱相对应的13 个特征峰，表明本文建立的特征图谱具有良好的适用性，见图4。

图4 5 批市售溃疡油与对照HPLC 图谱Fig 4 HPLC chromatogram of 5 batches of Kuiyang oil and reference

2.4 溃疡油中5 个成分的含量测定

2.4.1 专属性考察 分别取供试品、对照品、阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行检测。结果显示在供试品色谱中待测成分与其他成分分离度大于1.5，各阴性样品色谱中分别在欧前胡素、藁本内酯、异欧前胡素、大黄素、大黄酚色谱峰相应保留时间处，无相对应的色谱峰，表明各阴性样品与待测成分之间无干扰，色谱图见图3。通过色谱数据处理软件（AgilentChemStation）的光谱功能，对各色谱峰进行纯度检测，纯度因子均大于993，供试品中的待测成分色谱峰的光谱图与各对照品色谱峰的光谱图一致，表明该方法专属性良好。

图3 样品、对照品、单味药材、各阴性样品的HPLC 图谱Fig 3 HPLC chromatogram of sample，reference substance，single medicinal and negative samples

2.4.2 线性关系考察 精密量取“2.2.1”项下对照品混合溶液0.4、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 mL，分别置10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。将上述8 个质量浓度的对照品混合溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标（Y），对照品量（ng）为横坐标（X），进行线性回归，结果见表2。

表2 线性关系Tab 2 Linearity

2.4.3 精密度试验 取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6 次，测得欧前胡素、藁本内酯、异欧前胡素、大黄素、大黄酚峰面积的RSD分别为1.1%、0.77%、0.93%、1.1%、1.5%，结果表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、20、24 h 按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果欧前胡素、藁本内酯、异欧前胡素、大黄素、大黄酚的峰面积RSD分别为1.0%、1.0%、0.71%、1.7%、1.3%，结果表明供试品溶液中上述5 个成分在24 h 内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 取同一样品按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以外标法计算欧前胡素、藁本内酯、异欧前胡素、大黄素、大黄酚的含量，RSD分别为2.4%、1.4%、2.9%、2.4%、2.3%，结果表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收试验 精密量取混合对照品溶液5 mL，置具塞锥形瓶中，减压挥干溶剂，加入已知含量的样品（批号：20191205）1 g，混匀，制备6 份，按“2.2.2”项下方法处理，按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果欧前胡素、藁本内酯、异欧前胡素、大黄素、大黄酚的平均加样回收率（n＝6）分别为94.2%（RSD＝0.86%）、91.0%（RSD＝1.9%）、109.8%（RSD＝1.0%）、102.7%（RSD＝2.8%）、99.2%（RSD＝2.1%），回收率符合要求。

2.4.7 样品含量测定 分别取厂家A 溃疡油4 批及厂家B 溃疡油1 批，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，用外标法计算，结果见表3。

表3 样品含量测定结果(μg·g－1，n＝3)Tab 3 Samples determination (μg·g－1，n＝3)

3 讨论

3.1 指标成分的选择

通过文献[2-3]可知欧前胡素、异欧前胡素为白芷的有效指标成分，藁本内酯为川芎的有效指标成分，大黄素、大黄酚为大黄的有效指标成分，均具有专属性，故对溃疡油中上述5 种成分进行质量控制。

3.2 色谱条件的选择

通过文献[7-10]分析，选择乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液等作为流动相进行考察，并进行了比例优化，结果表明甲醇-0.2%磷酸溶液作为流动相通过梯度洗脱，所得色谱峰峰形较好，保留时间和峰面积较稳定。通过光谱分析，各成分最大吸收波长分别为欧前胡素（248、302 nm）、藁本内酯（280、330 nm）、异欧前胡素（250、312 nm）、大黄素（290 nm，并在240～280 nm 处有宽幅吸收）、大黄酚（257 nm），以上5 个成分均在254 nm 处有较大的紫外吸收，且基线平稳，无其他成分干扰。考察了Waters XBridge、Waters Sunfire 与Phenomenex C18色谱柱及柱温（30、35、40 ℃），结果表明Waters XBridge C18色谱柱，柱温40℃的分离效果最好。

3.3 提取方法的选择

考察了乙腈、甲醇作为提取溶剂，在相同条件下所得检测结果无明显差异，从溶剂的性质及成本考虑，最终选择甲醇作为提取溶剂。考察了回流提取和超声提取，在相同条件下检测结果无明显差异，从操作简便考虑，最终选择超声提取。并对提取时间（15、20、40、60 min）、溶剂用量（10、20、25 mL）进行了考察，结果表明溶剂用量20 mL、超声提取20 min 为最优提取条件。

3.4 样品含量测定结果

市售5 批样品中，各批次间的峰面积有一定差异（RSD为16.0%～48.9%），反映出各化学成分含量的差异性。这些差异可能来自于原料，也可能是贮存条件造成的。样品20180403 的图谱中，变化较大的4 号峰和7 号峰均来自于川芎，其中7 号峰对应的藁本内酯变化最大。对藁本内酯的稳定性研究表明，室温（18～25℃）避光条件下放置6 个月后，川芎挥发油中藁本内酯的质量分数由初始的59.89%降至18.10%[11]，因此样品20180403中藁本内酯的含量低于定量限，可能是由于贮存时间较长或温度偏高造成。另外，样品20180403、20191205 在保留时间29～35 min 处的色谱峰较其他样品有较大差异，可能受制备工艺、贮存条件等因素的影响，后续需要收集更多样品进一步研究。

3.5 结论

综上所述，本文建立的溃疡油HPLC 特征图谱方法和对有效成分的含量测定方法，不仅可以对该制剂中化学成分进行量化分析和质量评价，也可以为原料的筛选、制备工艺的优化、贮存稳定性的考察等方面提供参考。