大叶千斤拔的质量标准研究

郑元青，何风艳，张鹏，龚云*（.株洲千金药业股份有限公司，湖南 株洲 4000；.中国食品药品检定研究院，北京 00050）

千斤拔始载于《植物名实图考》，其性味甘、温，具有祛风湿、益脾肾，强筋骨之功效，主要用于治疗风湿骨痛、腰肌劳损、月经不调、痛经和白带多等妇科疾病[1-2]。2015年版《中国药典》四部收载其植物来源包含蔓性千斤拔Moghaniaphilippinessis（Merr.et Rolfe）Li、大叶千斤拔Moghania macrophylla（Willd.）O.Kuntze 和绣毛千斤拔Moghania ferruginea（Wall.ex Benth.）Li的干燥根[3]，其中绣毛千斤拔在国内分布较少，且未形成大宗商品[4]。在2009年版《湖南省中药材标准》中收载了千斤拔（蔓性千斤拔）FlenmingiaphilippinessisMerr.et Rolfe 的干燥根和大叶千斤拔F.macrophylla（Willd.）Prain 的干燥根和茎[5]，是中药材千斤拔的主要来源。按照一品一标的原则，本文对大叶千斤拔的性状、鉴别、检查、含量等质量情况进行深入研究。

妇科千金片/胶囊是千金药业自主开发并独家生产的纯中药制剂，占有妇科炎症类口服中成药20%的市场份额，其中千斤拔为其君药。黄酮类化合物是千斤拔中所含的主要成分类型[6-9]，代表性成分为染料木苷（genistin）和染料木素（genistein），两者均具有较强的抗氧化、类激素、抗菌、抗癌和保护心血管等主要作用[10-17]。千斤拔作为中成药妇科千金片、妇科千金胶囊、金鸡胶囊等的君药，在治疗妇科疾病和风湿病方面正是这类化学成分起着类激素作用和抗炎、抗氧化作用。因此，本文在湖南省地方标准的基础上，以妇科千金片/胶囊中的君药大叶千斤拔为研究对象，新增以染料木苷为对照品的薄层色谱（TLC）及高效液相色谱（HPLC）定性和定量检测方法，补充安全性评价指标，从建立性状、显微鉴别、薄层色谱、水分、总灰分、有机氯农药残留、重金属及有害物质、黄曲霉毒素、浸出物、特征图谱和含量测定各项研究方法，为大叶千斤拔的标准化建设提供基础，为保障千斤拔药材质量提供依据。

1 材料

1.1 仪器

e2695 高效液相色谱仪（Waters），Agilent 1260-6410B LC-MS 联用系统（Agilent），Mettler AE240、Mettler XS105DU 电子天平（梅特勒-托利多），KQ-300DA 型医用数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率300 W，频率40 kHz），TGL-16G 离心机（上海安亭科学仪器厂）；CAMAG Linomat V 半自动点样仪、CAMAGReprostar 3 薄层色谱数码成像系统（瑞士玛卡）。BX43 型生物显微镜（日本 Olympus 公司）；DHG-9140A 型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器公司）；SX2-4-10 型电阻炉（长沙市华光电炉厂）；iCAPRQ 电感耦合等离子体质谱仪（美国热电公司）；AFS830a 原子荧光光谱仪（中国吉天公司）。

1.2 试药

染料木苷对照品（批号：111709-201702，含量以99.9%计）及蔓性千斤拔对照药材（批号：121502-200802）（中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙酸（分析纯）、聚酰胺薄膜（国药集团化学试剂有限公司）；乙腈、冰醋酸（色谱纯，Fisher公司）；水为ddH2O。

药材均经千金药业QC 主管丁小明鉴定，其中大叶千斤拔[Moghania macrophylla（Willd.）O.Kuntze]15 批，蔓性千斤拔[Moghania philippinessisMerr.et Rolfe Li]1 批，绣毛千斤拔[Moghania ferruginea（Wall.ex Benth.）Li]1批，山豆根（Sophoratonkinensis Gagnep）1 批，药用部位均为根（见表1）。

表1 样品来源Tab 1 Sample source

2 方法与结果

2.1 大叶千斤拔根的性状

根据样品实际情况并参照各地方标准描述，根有多数分支，根头部常呈结节状膨大，长5～10 cm，直径0.5～8.0 cm；表面灰棕色或红棕色，有细纵纹及横长皮孔样斑痕；质硬，不易折断；切面皮部薄，棕红色；木部淡红色，具放射状纹理；微具豆腥气，味微甘涩。

图1 大叶千斤拔根Fig 1 Roots of Moghania macrophylla（Willd.）O.Kuntze

2.2 根横切面显微特征

大叶千斤拔根横切面特征如下：

① 木栓层由数列木栓细胞组成。② 皮层具数列椭圆形薄壁细胞。③ 韧皮部纤维成束或散在，壁厚，微木化；分泌细胞单个散在或数个成群存在，内含黄棕色或红棕色物；韧皮射线明显。④ 形成层明显。⑤ 木质部导管单个散在或数个相连，径向排列；木纤维成片，壁厚，木化；木射线宽1～5 列细胞；薄壁细胞内含草酸钙方晶、淀粉粒和黄棕色物。具体见图2。

图2 根横切面特征图Fig 2 Microscopic characteristics of roots

2.3 TLC 鉴别

取样品粗粉约1 g，加甲醇10 mL，超声处理30 min，过滤，取滤液，作为供试品。另取染料木苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含0.2 mg 的溶液，作为对照品溶液。参照薄层色谱法（2015年版《中国药典》四部通则0502）试验，吸取对照品溶液1 µL、供试品溶液2 µL，分别点于同一聚酰胺薄层板上，以36%乙酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铝乙醇溶液，热风加热1 min，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果显示，供试品色谱在与对照品相应的位置上，显相同颜色的斑点，且大叶千斤拔与伪品山豆根的色谱有明显区别，详见图3。

图3 千斤拔薄层色谱图Fig 3 TLC chromatogram of Moghania macrophylla

2.4 水分

按 2015年版《中国药典》四部水分测定法[3]项下方法测定样品水分。结果表明，15 批样品水分在 8.02%～9.72%（见表2），故拟订大叶千斤拔含水分不得过 12%。

表2 大叶千斤拔各项指标测定结果Tab 2 Determination of Moghania macrophylla

2.5 总灰分

按 2015年版《中国药典》四部总灰分测定法[3]测定样品灰分。结果表明，15 批样品总灰分在1.67%～4.68%（见表2），故拟订大叶总灰分不得过 6.0%。

2.6 浸出物

按 2015年版《中国药典》四部醇溶性浸出物测定法项下的热浸法[3]测定样品浸出物。结果表明，15 批样品浸出物在 8.76%～16.33%（见表2），均值下浮 20%为10.3%，故拟订大叶千斤拔浸出物不得少于10%。

2.7 重金属及有害物质

按照2015年版《中国药典》四部铅、镉、砷、汞、铜的测定法[3]测定样品重金属及有害物质。结果表明，15 批样品铅在0.24%～0.94%，镉在0.023%～0.060%，砷在0.10%～0.14%，汞在0.0024%～0.0052%，铜在3.37%～6.40%。参考2015年版《中国药典》一部甘草、白芍、西洋参等品种项下的相关规定，拟订大叶千斤拔重金属及有害物质的限度：铅不得过5 mg·kg－1，镉不得过1 mg·kg－1，砷不得过2 mg·kg－1，汞不得过0.2 mg·kg－1，铜不得过20 mg·kg－1。

2.8 有机氯类农药残留

按照2015年版《中国药典》四部农药残留量测定法项下第一法[3]测定样品有机氯类农业残留。结果表明，15 批样品总六六六、总滴滴涕、五氯硝基苯均为0。

2.9 黄曲霉毒素

按照2015年版《中国药典》四部黄曲霉毒素测定法项下的第二法[3]测定样品。结果表明，15批样品黄曲霉毒素浓度在0～3.79 µg·kg－1。参考2015年版《中国药典》一部大枣、肉豆蔻等品种项下的相关规定，拟订大叶千斤拔黄曲霉毒素的限度：每1000 g 含黄曲霉毒素B1不得过5 μg，黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2和黄曲霉毒素B1总量不得过10 μg。

2.10 含量测定

2.10.1 对照品溶液的制备 取染料木苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1 mL 含染料木苷46 μg 的溶液，即得。

2.10.2 供试品溶液的制备 取样品，粉碎，过三号筛，称取粉末约1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30 min，放冷，称定重量，补重，摇匀，6000 r·min－1离心10 min，取上清液经0.45 μm 滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.10.3 色谱条件 采用 Agilent Zorbax SBphenyl 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.5% 乙酸水溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，10%→20%A；20～40 min，20%→30%A；40～60 min，30%→50%A；60～80 min，50%→70%A；80～90 min，70%→90%A），流速1.0 mL·min－1，柱温 30 ℃，检测波长260 nm。理论板数按染料木苷峰计算应不低于3000。

2.10.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。典型色谱图见图4。

图4 千斤拔高效液相色谱图Fig 4 HPLC chromatogram of Moghania macrophylla

2.10.5 方法学验证

① 线性关系考察：取染料木苷对照品溶液，分别配制成5、10、20、40、64、80 μg·mL－1，进样体积为10 μL，记录峰面积。以进样量为横坐标X，峰面积为纵坐标Y绘制标准曲线并进行线性回归，线性范围0.05～0.80 ng，回归方程Y＝6×106X－2.679×104，相关系数0.9999，表明线性关系良好。

② 精密度试验：取“2.10.1”项下对照品溶液连续进样6 次，染料木苷峰面积的RSD为0.5%，表明方法精密度良好。

③ 稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、16、24 h 进样测定峰面积，染料木苷峰面积的RSD为1.1%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

④ 重复性试验：分别精密称取同一千斤拔样品6 份，按“2.10.2”项下方法制备供试品溶液，测得染料木苷平均含量为1.30 mg·g－1，RSD为2.0%，表明方法重复性良好。

⑤ 加样回收试验：精密称取已知成分含量的千斤拔样品0.5 g，精密加入0.02 mg·mL－1染料木苷对照品溶液25 mL，按“2.10.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，进样测定，结果染料木苷的平均回收率分别为96.7%，RSD为1.3%，符合要求。

⑥ 耐用性试验：取同一供试品溶液，采用3种高效液相色谱仪、3 根不同品牌的苯基柱进行测定，染料木苷含量的RSD为1.5%，表明方法的耐用性较好。

2.10.6 样品测定 取15 批样品各适量，参照文献方法[18]检测样品含量。结果染料木苷的平均含量为 0.06%，以该值下调 20%则为 0.048%，故拟订本品含染料木苷含量不得少于 0.04%。

3 讨论

目前，千斤拔药材的质量标准未收录至《中国药典》，在云南、广西、湖南等省的地方标准中仅体现为性状、鉴别、浸出物等检查项。本文在此基础上新增含量、重金属及有害物质、黄曲霉、有机氯农药残留的研究，为其质量标准提升提供数据支撑；在现有地方标准中薄层鉴别方法多使用千斤拔对照药材（蔓性千斤拔）或者羽扇豆醇对照品，本文新建以染料木苷为对照的大叶千斤拔的薄层鉴别方法，使其能有效的区别同为豆科的山豆根（混淆品），增强了方法专属性。在薄层色谱方法中笔者对比了G254 薄层板和聚酰胺薄层板，对照物质考察了千斤拔对照药材、染料木苷、染料木素，发现聚酰胺薄层板的斑点更加清晰，分离效果更好；大叶千斤拔与对照药材两者在固定相上区别较为明显，主斑点数及颜色都有差异；染料木素和染料木苷两个成分极性相差较大，同时在薄层板上作为对照品的效果不理想，而染料木素的分离效果不如染料木苷。最终条件选择了聚酰胺薄层板，以染料木苷为对照，以36%乙酸为展开剂建立检测方法，条件简单，易于操作。

考察了不同的提取方式、提取溶剂和提取时间对色谱图的影响。结果表明染料木苷色谱峰受提取方式的影响较大。6''-O-丙二酰染料木苷对热不稳定[19]，加热时会转化为染料木苷，因此，本研究选择超声提取的方式以避免加热导致6''-O-丙二酰染料木苷转化。3 种溶剂中70%甲醇的提取效率最优，而30 min 与60 min 的提取效果相近，最终选择70%甲醇超声提取30 min。

大叶千斤拔的主要成分包括糖类、苷类、黄酮类、鞣质、酚类、氨基酸、甾体、皂苷、有机酸、生物碱、挥发油、蒽醌类化合物等[20]，其中染料木苷成分药理作用丰富，是含量较高的黄酮类成分，且保留时间靠前，分离度、色谱峰纯度等方面均符合含量测定要求，故选定染料木苷作为大叶千斤拔药材含量测定的指标。