UPLC-MS/MS法测定利奈唑胺及其中间体（S）-N-（2-乙酰氧基-3-氯丙基）乙酰胺中的遗传毒性杂质（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇

刘峰，赵荣丽，王璐（.四川省药品检验研究院，成都 673，.成都生物制品研究所有限责任公司，成都6003）

利奈唑胺（linezolid）是美国Pfizer 公司研发的第一个噁唑烷酮类抗菌药物，化学名为N-[[（5S）-3-[3-氟-4-（4-吗啉基）苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺，其2000年获得美国FDA 批准，用于治疗革兰氏阳性菌引起的感染，包括由金黄色葡萄球菌引起的疑似或确诊院内获得性肺炎、社区获得性肺炎、复杂性皮肤或皮肤软组织感染以及耐万古霉素肠球菌感染。利奈唑胺为细菌蛋白质合成抑制剂，作用于细菌50S 核糖体亚单位的作用部位。由于其作用部位和方式独特，故不易与其他抑制蛋白合成的抗菌药物发生交叉耐药，在体外也不易诱导细菌耐药性的产生[1-3]。利奈唑胺临床应用文献报道较多，临床关注度高，但其药学研究尤其质量控制内容较少。

利奈唑胺有多条合成路线，（S）-N-（2-乙酰氧基-3-氯丙基）乙酰胺（[（2S）-1-acetamido-3-chloropropan-2-yl]acetate，以下简称ACPA）是原研工艺中的关键中间体，利奈唑胺多通过这个关键中间体合成[2-4]。ACPA 的合成会用到（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇，该物质具有基因毒性警示结构[4-9]，可能在ACPA 中残留，导致在终产品利奈唑胺中残留。目前（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇的测定方法尚未见文献报道[10-13]，本文所建方法灵敏度高、方法简便可靠、适用性强，可为利奈唑胺的质量控制提供参考，采用遗传毒性杂质过程控制和终产品控制的质控理念，充分保障利奈唑胺临床使用的安全性。

1 材料

1.1 仪器

岛津LC-30 系列高效液相色谱仪（日本岛津公司）；API 4000 三重四极杆质谱仪，软件版本：Analyst Version：1.6.3（美国AB Sciex 公司）；CPA255D 十万分之一天平（德国赛多利斯公司）；XA205DU 十万分之一天平（瑞士梅特勒托利多公司）；BioHit 移液枪（德国赛多利斯公司）。

1.2 试药

（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐对照品（PCL 公司，批号：PCL-#-Am2333，含量：100%）；ACPA 样品（成都海亚特科技有限责任公司，批号：170901、181101、190101）；利奈唑胺样品（四川百利药业有限责任公司，批号：171001、171002、171003）；甲醇、甲酸为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×50 mm，2.7 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸甲醇溶液（B），梯度洗脱（0～2 min，20%B；2～6 min，20%→90%B；6～8 min，90%B；8～9 min，90%→20%B；9～10 min，20%B），流速0.3 mL·min－1，柱温35℃，进样量2 μL。

2.2 质谱条件

质谱条件：采用电喷雾离子源正离子模式（ESI＋），多反应监测模式（MRM）测定，气帘气30 psi，GS1 50 psi，GS2 50 psi，IS 5500，TEM 500℃，定量离子对为质荷比（m/z）110.0→91.9，DP 41，CE 14，CXP 5，EP 8，定性离子对为m/z110.0→56.1，DP 41，CE 20，CXP11，EP 8。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐对照品11.04 mg [相当于（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇8.36 mg]，用50%甲醇溶液溶解并稀释制成（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇质量浓度约为0.8 mg·mL－1的对照品储备液。精密量取对照品储备液适量，用50%甲醇溶液稀释成约0.04 μg·mL－1的对照品溶液。

2.3.2 灵敏度试验溶液的制备 精密量取对照品溶液1 mL 置10 mL 量瓶中，用50%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为灵敏度试验溶液。

2.3.3 利奈唑胺供试品溶液的制备 精密称取利奈唑胺适量，用50%甲醇溶解并稀释成约3.5 mg·mL－1的溶液，作为供试品溶液。

2.3.4 ACPA 供试品溶液的制备 精密称取ACPA 适量，用50%甲醇溶解并稀释成约为0.1 mg·mL－1的溶液，作为供试品溶液。

2.4 专属性与系统适用性试验

取空白溶剂（50%甲醇溶液）、利奈唑胺供试品溶液、ACPA 供试品溶液、对照品溶液与灵敏度试验溶液，进样分析。结果空白溶剂不干扰待测组分测定；利奈唑胺在此条件下无质谱峰出现，ACPA 有质谱峰，但不干扰（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇的测定；灵敏度试验溶液中定量离子峰的信噪比大于10。

图1 典型质谱图Fig 1 Typical mass spectrum

2.5 线性关系考察

取“2.3.1”项下对照品储备液进行稀释，得系列对照品溶液，进样分析。以（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇质量浓度作为横坐标（x），相应峰面积作为纵坐标（y），绘制标准曲线，结果（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇在0.836～208.989 ng·mL－1内与峰面积线性关系良好，y＝5.283×103x＋6.79×103，r＝0.9996。

2.6 检测限与定量限考察

精密量取“2.3.1”项下对照品储备液适量，以50%甲醇溶液逐级稀释，进样分析，记录质谱图。以信噪比（S/N）约为3 时的质量浓度作为检测限（LOD），S/N约为10 时的质量浓度作为定量限（LOQ），结果LOD 为0.279 ng·mL－1，LOQ 为0.774 ng·mL－1。

2.7 精密度试验

精密吸取“2.3.1”项下对照品溶液、“2.6”项下LOQ 溶液，连续进样6 次，记录色谱图，考察进样精密度和定量限精密度，结果（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇峰面积的RSD分别为0.80%、3.6%，表明本法进样精密度、定量限精密度良好。

2.8 稳定性试验

精密吸取“2.3”项下对照品溶液、利奈唑胺供试品溶液和ACPA 供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 h，进样测定，记录色谱图，考察溶液稳定性。结果对照品溶液中（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇峰面积的RSD为2.3%，利奈唑胺供试品溶液和ACPA 供试品溶液中均未检出（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇，表明各溶液在20 h 内均稳定。

2.9 加标重复性试验

取利奈唑胺（批号：171001）样品，ACPA（批号：190101）样品适量，各6 份，按“2.10.1”项下准确度100%样品制备方法制备，进样测定，记录峰面积，考察加标重复性。结果利奈唑胺中（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇平均含量为11.45 μg·g－1，RSD为0.75%（n＝6），ACPA 样品中（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇平均含量为0.041%，RSD为2.3%（n＝6）。表明本法重复性良好。

2.10 准确度试验

精密量取“2.3”项下（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇对照品储备液1 mL，置200 mL 量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品准确度溶液①；再精密量取5 mL，置50 mL 量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品准确度溶液②。

2.10.1 利奈唑胺准确度试验 精密称取利奈唑胺样品（批号：171001）约35 mg，共9 份，置10 mL 量瓶中，分别精密加入对照品准确度溶液②0.5、1.0、1.5 mL，各3 份，按“2.3.3”项下方法制备准确度试验50%、100%、150%的供试品溶液，进样测定，计算回收率。

2.10.2 ACPA 准确度试验 精密称取ACPA 样品（批号：190101）约10 mg，共9 份，置100 mL量瓶中，分别精密加入对照品准确度溶液①0.5、1.0、1.5 mL，各3 份，按“2.3.4”项下方法制备准确度试验50%、100%、150%的供试品溶液，进样测定，计算回收率。

结果利奈唑胺中（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇的高、中、低浓度平均回收率分别为96.6%（RSD＝1.1%）、97.6%（RSD＝1.3%）、97.5%（RSD＝0.52%）。ACPA 中（S）-1-氨 基-3-氯-2-丙醇的高、中、低浓度平均回收率分别为101.6%（RSD＝1.6%）、101.8%（RSD＝2.2%）、105.6%（RSD＝1.3%）。

2.11 耐用性试验

取利奈唑胺（批号：171001）和ACPA（批号：190101）样品，分别按“2.10.1”项下准确度100%供试品溶液制备方法配制加标供试品，按以下方式处理：① 考察流速0.2、0.4 mL·min－1；② 考察柱温30、40℃；③ 考察梯度洗脱程序：梯度为0～2 min，15%B；2～6 min，15%→90%B；6～8 min，90%B；8～9 min，90%→15%B；9～10 min，15%B；和梯度为0～2 min，25%B；2～6 min，25%→90%B；6～8 min，90%B；8～9 min，90%→25%B；9～10 min，25%B。结果利奈唑胺加标供试品溶液中（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇含量平均值为11.61 μg·g－1，RSD为1.6%；ACPA 加标供试品溶液中（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇含量平均值为0.040%，RSD为1.9%，表明色谱条件发生一定变化时本法耐用性良好。

2.12 毒性杂质的含量测定

取利奈唑胺样品与ACPA 样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，结果3 批利奈唑胺均未检出（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇；170901、181101 批ACPA 中（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇含量分别为0.043%、0.006%，190101 批ACPA 中未检出。

3 讨论

3.1 检测方法的筛选

（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇分子结构中无生色基团，无明显紫外吸收，且具有基因毒性警示结构。其控制限度较低，故采用灵敏度较高的液质联用法（UPLC-MS/MS）进行测定。先采用针泵注射进样方式，利用质谱仪对待测物的准分子离子峰和碎片离子的DP、EP、EP、CXP 值分别进行优化。由于（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇的对照品为其盐酸盐，在溶液中氯离子与（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇解离，因此准分子离子峰选择m/z110.0，定量离子选择丰度较高的m/z91.9，定性离子选择丰度稍低的m/z56.1。

首先采用Waters ACQuity UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色谱柱，以0.1%甲酸水溶液为流动相A，0.1%甲酸甲醇溶液为流动相B进行梯度洗脱，对（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇进行试验，发现其在该色谱柱上几乎无保留，在0.5 min 左右即出峰，出峰时间太早。更换Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）色谱柱进行试验，并调整梯度程序，（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇在约1.7 min 时出峰，ACPA 在约5.5 min 时出峰，峰形较好，空白溶剂无干扰，ACPA 与利奈唑胺均无干扰峰，此色谱条件适用于（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇的分析检测。另考察了制备供试品溶液的溶剂，APCA 与（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐对照品在水中溶解性均良好，但利奈唑胺在水中溶解性较差，为了使色谱条件能同时对利奈唑胺和ACPA 中的（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇进行测定，简化操作流程，最终选用三者溶解性均较好的50%甲醇溶液作为供试品溶液的制备溶剂。

3.2 控制策略

按照ICH M7 和《中国药典》2020年版四部通则9306 的相关要求，均需重点关注致突变的遗传毒杂质，（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇为潜在遗传毒杂质，一般采用过程（中间）控制、终产品控制以及过程（中间）控制＋终产品控制，由于利奈唑胺的中间体APCA 有部分批次检出，且检出量超过采用TTC 法（毒理学可关注阈值）计算出的安全限值15 μg·g－1，而片面控制APCA的纯度，可能大幅增加生产成本，不符合药物经济学的基本要求，因此本品采用了中间控制＋终产品控制的控制策略，规定在中间体APCA 中（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇不得过0.05%，终产品利奈唑胺中（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇不得过15 μg·g－1。