前列腺癌人源性肿瘤异种移植模型的发展与应用

段剑礼，陈 征，王玉琢

1.中山大学附属第六医院泌尿外科（广州 510655）

2.暨南大学附属第一医院泌尿外科（广州 510630）

3.不列颠哥伦比亚大学泌尿系研究所（加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市 V5Z1M9）

2021年最新数据显示全球有超过141万例前列腺癌（prostate cancer，PCa）新发病例，在全部肿瘤新发病例中高居第三，相关死亡病例有37.5万例，是男性的第五大死因[1]。中国男性自60岁起进入PCa发病高峰期，且PCa发病率与死亡率随年龄增长呈上升趋势，并有逐步低龄化的征象[2-3]。研究数据表明，由于患者之间存在个体差异，约15%的PCa患者有较高的疾病进展风险，对相同的治疗方案表现出高复发、易转移和高致死率等特点，增加了患者预后的不确定性[4]。随着精准医学的发展，根据PCa患者的个体化肿瘤特征施行不同的治疗方案是未来的主要发展方向[5-6]。在免疫缺陷的小鼠中构建人源性肿瘤异种移植（patient-derived tumor xenograft，PDX）模型，不仅可以避免肿瘤细胞被异体攻击，更重要的是可借助小鼠体内微环境模拟人体内肿瘤细胞的适宜生长环境，更完整的保留亲代基因型，降低外界对基因突变的干扰，较好的体现了个体化肿瘤特征[7]。PDX模型在研究癌症进展、制定个体化治疗方案和临床前药效测试等方面发挥着独特的优势，被广泛应用于肿瘤的研究中。本研究主要围绕PDX模型在男性PCa中的相关研究进行综述。

1 前列腺癌PDX模型的构建

完整的PDX模型构建包括人源肿瘤组织的获取、免疫缺陷小鼠的选择和植入部位的选择三部分。

1.1 人源肿瘤组织的获取

获取人体PCa组织的主要方式是手术切除和肿瘤病灶穿刺。将获取的肿瘤组织先放至培养液中转运至实验室，PBS清洗后在无菌操作下切成3～4 mm小碎块或直接裂解为单个细胞的悬浮液，再将其导入小鼠的预定种植位置即完成前列腺肿瘤的初次接种[8]。为提高肿瘤种植的成功率，常将基质胶或成纤维细胞等与肿瘤微环境相关的物质一同注入小鼠体内，肿瘤增长稳定后，可进行再次传代或冻存，但经冻存的肿瘤组织其传代效率相对较低[9-10]。

1.2 免疫缺陷小鼠的选择

1976年，Schroeder等首次将人源性PCa组织种植到裸鼠中并成功回收，同时设计对照试验验证了雄激素在人PCa组织来源的异种移植中具有重要作用，此后裸鼠在PCa的PDX模型中被广泛应用[11]。此类小鼠的优势在于通体无毛发较易观察皮下成瘤的范围，同时由于先天缺乏胸腺细胞导致裸鼠无细胞免疫，有利于异种肿瘤细胞的生长。但裸鼠的不同基因遗传背景可影响异种移植的成功率，且裸鼠体内仍保留部分体液免疫和非特异性免疫，使得裸鼠尚不能制成最理想的PDX模型[12]。SCID小鼠因Prkdc基因突变导致细胞免疫和体液免疫双重缺失，减少了肿瘤被攻击的可能性。该类小鼠拥有较完善的非特异性免疫系统，随年龄增长体内可能会产生T细胞和B细胞，称为渗漏现象[13]。基于此，后续研究对SCID小鼠进行改良，开发出拥有低活性NK细胞和低渗漏率的NOD-SCID小鼠和缺乏NK细胞的NSG小鼠，并在PCa-PDX模型构建中均取得不错的效果[14-15]。由于NOD-SCID和 NSG小鼠价格昂贵，对生长环境要求较高，目前在PCa-PDX模型构建中应用最广泛的仍是裸鼠和SCID小鼠。

1.3 植入部位的选择

常用的植入部位包括皮下种植、原位种植和肾包膜种植。皮下种植指将人源性肿瘤碎片直接种植于小鼠皮下，优点包括操作简便，易上手，同时可清晰监测肿瘤生长。裸鼠的皮下种植均可肉眼观测肿瘤的生长情况，方便测量与完善实验计划。皮下种植部位常取血供相对丰富之处，如双侧腹股沟及腋下等，但由于皮下血供的天然劣势，皮下移植的成功率不稳定，在20%～75%范围内波动[16-17]。同时，皮下种植的肿瘤很少发生转移和扩散，常为聚集性成团，不利于肿瘤侵袭性实验的开展。

原位种植指直接将人源性PCa接种在小鼠前列腺部位，其血供相对皮下更为丰富，一定程度上提高了种植的成功率。原位种植可模拟最接近人类PCa发生发展的微环境，充分考虑了实验调控指标及各项体内因素对PCa生长的影响，使PDX模型实验数据更加可信。接种于原位的肿瘤可增加转移的成功率，较好的模拟肿瘤在前列腺部位的进展过程，故在大多数PCa转移模型研究中均优先考虑使用原位种植[18-19]。但原位种植技术难度较高，需耗费大量时间学习及操作，种植后通常需要借助超声或探查性手术来确认肿瘤的生长情况，在日常肿瘤测量及转移检测中均离不开影像学的支持。

Wang等率先成功将人体PCa组织种植于肾包膜下，开创了肾包膜下种植体系[20]。相比前两种方案，肾包膜下种植更好地体现了人源性PCa的特征，不仅完整保留了原发PCa组织的分子特征、肿瘤异质性、转移能力以及对治疗的反应性等关键生物学特性，还因血供充足大幅度提高了肿瘤种植的成功率（50%～95%）。同时，该技术还可从冷冻库中回收PDX，提高模型的使用效率。目前活体肿瘤实验室（the living tumor laboratory，LTL）使用肾包膜下移植技术，已成功建立超过250种可移植的PDX模型，广泛用于各种良恶性肿瘤的基础研究、转化研究以及个体化研究中，体现了肾包膜下种植的独特价值。但该技术仍有不足之处：①操作复杂，需要熟练的技术人员完成；②对小鼠手术损伤较大，增加了感染的风险；③因小鼠肾脏较小且肾包膜较脆弱，操作过程需更加精细；④与原位种植一样，该方式也需要依靠影像学技术进行长期观察[21]。

值得注意的是，种植成功率除受构建PDX模型时的操作步骤和方式选择影响外，还受以下因素影响：①雄激素水平，高、低剂量的雄激素补充对肿瘤种植的生长有不同影响，故在补充雄激素时需预先估测阈值；②组织的离体时间，由于离体组织内部处于缺氧状态，离体时间越长，种植成功率越低，提示种植时应保持组织的新鲜，并尽可能切成薄片以利于组织的氧供；③基质微环境，PDX模型的生长与载体的基质微环境息息相关，使用新生鼠精囊间质、基质胶或层粘连蛋白等与肿瘤切片混合可重建小鼠体内肿瘤基质微环境，提高种植成功率[22-25]。

2 PDX模型的优势与不足

C4-2、LNcap、DU145等PCa细胞系的体外模型或将细胞系直接种植至小鼠体内构建体内模型仍是目前应用最广泛的研究工具，但由于细胞系本身与患者自身肿瘤差异性较大，时常会导致实验结果与临床应用并不一致[26]。相比于传统的细胞培养和类器官模型，PDX模型的优势在于：①完整保留了人体肿瘤的基因，拥有更加接近于个体的异质性，有利于肿瘤基因组的研究和治疗；②保持了肿瘤在组织学上的持续性，在肿瘤转移的研究中作用显著；③接受体内微环境调控和内分泌系统的影响使实验结论更为客观。

但PDX模型也存在一定缺陷。如模型构建相对复杂且成本昂贵，目前仍缺乏大规模量产的技术。初代PDX生长速率几天到几个月不等，而次代及后续的PDX模型大约需要40～50天才能获得理想大小的肿瘤[27]，且大多数会在数次传代中停止增殖并逐步衰老[28]。此外，鉴于动物体内微环境与人类有所差异，该技术的发展还受限于异种动物的免疫系统。

值得一提的是，使用同一亲本来源的组织样本进行体内外双重验证已逐步成为精准医学的共识。类器官是一种三维的培养方式，即提取来自人体的器官细胞在特定培养环境下增殖成类似器官的小团，为组织功能的体外实验提供了新方式。由于类器官和原始PDX模型之间的转录组和基因组特征高度一致，故可进行相关PDX模型的药物敏感性筛选和基因编辑等实验。有研究利用类器官培养技术实现了去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC）PDX模型的体外扩增和机制研究[29]。条件性重编程细胞（conditional reprogramming cell，CRC）技术是指提取人源性细胞并与射线照射后的小鼠成纤维细胞Swiss 3T3-J2进行共培养，从而使人源性细胞长期稳定传代，该技术改良了原代细胞培养模式，提高了人源性细胞的扩增产量[30]。Ci等将PCa组织在体外培养成稳定扩增的CRC细胞，再将该细胞移植于NOD / SCID小鼠的肾包膜下，构建自发性神经内分泌型前列腺癌（neuroendocrine prostate cancer，NEPC）的PDX模型，不仅保持了肿瘤与人体的基因一致性，还解决了PDX模型不能大量扩增的难题，同时亦可以在体内外实现高通量化学药物筛选和基因修饰，为PDX模型的构建和应用提供了新的思路[31]。PCa中传统细胞系、类器官培养、PDX模型差异见表1。

表1 PCa中传统细胞系、类器官和PDX模型的比较Table 1.Comparison of traditional cell lines,organoids and PDX models in PCa

3 PDX模型在前列腺癌中的应用

3.1 PDX模型在局限性前列腺癌中的应用

PC-82是1977年建立的第一个雄激素依赖的PCa PDX模型，来源于1例行根治性切除术的58岁男性患者，经过去势和雌激素治疗后，该模型的生长速度可逐步减缓并退化[32]。随后，PCa各个类型的 PDX模型开始被建立并逐步在体内实验中发挥重要作用（表2）。在1991年至2005年期间，有研究分别从156例患者中收集了261个PCa样本，并将其皮下植入雄性SCID小鼠中，这些PDX模型被统一命名为LuCaP PDX[33]，LuCaP 系列基本涵盖了常见的PCa类型，其中从21个原位PCa组织中成功构建了4个局限性PCa的PDX模型，它们很好地验证了人类PCa的主要基因组和表型特征的改变，如雄激素受体的扩增、PTEN缺失、TP53缺失和突变、RB1丢失、TMPRSS2-ERG重排、SPOP突变等。

表2 部分PCa PDX模型的构建及应用总结Table 2.Construction and application of PDX Model in PCa

原发性PCa的转移机制是当前研究热点。一项研究将局限性PCa不同部位的组织切片制成不同的PDX模型，通过原位种植到小鼠前列腺中来测试每个亚系的转移能力，发现LTL-220N和LTL-221N亚系是非转移性的，而LTL-220M亚系在体内可自发转移，提示在局限性PCa中只有少数癌细胞具有转移潜能[34]。将局限性PCa组织种植于雌性小鼠体内可显著抑制肿瘤生长，提示雌二醇可以通过与雄激素作用无关的机制在动物模型中抑制PCa的生长，对PCa的早期治疗有指导意义[35]。值得注意的是，PCa PDX模型用来评估药物的治疗效果时成本较高且不一定时时准确，有研究将PCa PDX模型中的肿瘤组织切片，在体外培养约6天后测试其对雄激素拮抗剂的敏感性，发现恩杂鲁胺可显著降低AR阳性肿瘤切片的增殖能力，促进细胞凋亡并降低了PSA的分泌，此结果与体内实验一致，提示这种离体组织切片拥有与本体一致的药敏特点，合理利用此模型可极大降低实验动物的数量和成本[36]。

3.2 PDX模型在转移性前列腺癌中的应用

转移是PCa致死的主要原因，寻找检测指标和新型治疗方法至关重要。若能准确预测原发PCa的转移情况，将为患者提供更加精准的治疗方案。Lin等将来自患者的转移性PCa组织块种植到肾包膜下，经5次连续种植后进行原位种植，观察肿瘤转移的发生和进展，其中PCa1-met是从淋巴结中分离出的亚型，已证明在47个宿主中均可侵犯至多个器官，如淋巴结、肺、肝、肾、脾脏和骨骼等，同时在与局限性PCa进行基因组对比分析时发现，ASAP1与PCa的转移紧密相关，可作为新型肿瘤标志物[42-43]。另一研究对5个不同类型PCa-PDX模型进行全基因组及全转录组测序，发现间质来源的转移信号是PCa转移的独立预测指标，不仅可以预测早期肿瘤的转移潜能，还对早期PCa患者的治疗选择有指导意义[38]。EphA2在PCa中的表达与肿瘤的侵袭性有关，而一线用药恩杂鲁胺会诱导其在PDX模型高表达，使用EphA2降解剂可极大减少原位种植肿瘤的转移，提示该药在转移性PCa中有广阔的应用前景[44]。

目前已经开发出多种高转移性PCa模型。LAPC-9是在长期去势环境中产生的适应性雄激素非依赖型PDX模型[45]。BM18是应用较多的骨转移PDX模型，显示出PSA、AR和CK-18蛋白阳性并对雄激素敏感，且BM18对紫杉烷类化合物和多激酶抑制剂表现出较高的敏感性[46]。利用LAPC-9和BM18在不同激素水平下的差异进行分析，发现雄激素敏感性不同的转移性PCa PDX模型触发了不同的基质反应，并鉴定出具有50个基因的基质标记分子，这些基质标记分子与格里森评分、转移进展和无进展生存率等呈线性关系[47]。

3.3 PDX模型在去势抵抗性前列腺癌中的应用

雄激素剥夺治疗是转移性PCa的标准治疗方案，但是多数患者最终会进展为CRPC，对CRPC的机制研究和临床处理仍是泌尿外科的难点。从基因层面分析CRPC改变的原因能够更好的诊断与判断预后，有研究成功构建了20个来源于CRPC患者的PDX模型，并证实传代后肿瘤染色体改变与患者中的基本一致[29]。通过对8例CRPC-PDX模型的分析，发现AR阴性的CRPCPDX模型中UBE2C基因的表达显著高于AR阳性的腺癌模型，且CRPC-PDX模型中的AR、RB和CCND1启动子区域均未甲基化[48]。

对CRPC患者的临床治疗评估也是研究的重点。阿比特龙对部分CRPC患者有效，但会产生耐药性，将CRPC-PDX模型用阿比特龙进行治疗，利用基因表达和免疫组化等方式探索阿比特龙耐药机制和潜在靶点，借此发现阿比特龙耐药相关的分子标志物，并证明了阿比特龙耐药时会产生持续的AR / GR信号，对后续CRPC患者的治疗提供新的思路[49]。有研究利用CRPC-PDX模型进一步证实了转录共激活因子CBP / p300对维持CRPC生长的意义，并由此开发出CBP / p300小分子抑制剂，在体内外抑制了PCa的生长[50-51]。耐阿比特龙的PDX模型LuCaP 58被用于研究CRPC患者骨转移的治疗方案，发现镭-223可有效抑制肿瘤诱导的成骨细胞生长并保护了正常的骨骼结构，同时还能降低小鼠体内PSA水平并缩小肿瘤的总体积，提示镭-223可限制骨中PCa的增殖[52]。近期，靶向降解剂研究在PCa中取得突破性进展，其中小分子ARV-110是一种降解AR的口服靶向嵌合体类药物，与AR特异性结合并介导其降解，在所有癌细胞系及PDX模型中，该药对恩杂鲁胺治疗不敏感的肿瘤显示出有效的抑制性。对在标准治疗方案上有所进展的mCRPC患者有极大帮助，目前美国Arvinas 公司已开始对ARV-110进行相关的临床试验[53]。

3.4 PDX模型在神经内分泌型前列腺癌中的应用

PCa发展的晚期阶段通常以对雄激素不敏感的快速增殖状态为特征，一些晚期肿瘤主要由神经内分泌细胞组成，称为NEPC。NEPC体内研究的基础是构建合适的PDX模型，LuCaP系列已成功建立了5种NEPC-PDX模型，其中LuCaP 49稳定增殖了4年，该模型来源于1例BII期PCa患者的转移性淋巴结，拥有更快的倍增时间（平均6.5天），对雄激素剥夺治疗不敏感，缺乏AR和PSA但表达突触素、CD57等神经内分泌蛋白等特征。此外，源于前列腺尿道切除术的LuCaP 93、肝转移的LuCaP 145.1和LuCaP 173.1以及淋巴结转移的LuCaP 145.2等均表现出NEPC特征和相似的基因组特征[33,39]。LTL通过穿刺活检提取组织制成局限性PCa PDX模型，去势后长时间暴露于缺乏雄激素的环境中自动转化为NEPC，由此建立了首个由腺癌自发向NEPC转分化的PDX模型，称为LTL331/331R。该模型可完全表征供体患者的疾病特征，其发展方式提示局限性PCa可以通过适应性反应直接演变为高危性PCa[24,31]。目前，LTL331/331R模型被用于整个转分化过程中的基因组、转录组和表观遗传学等研究方向。利用该模型在NEPC的多项研究中发现DEK蛋白、转录因子BRN2、丝氨酸/精氨酸重复基质4（SRRM4）、异染色质蛋白1α（HP1α）、转录调节因子ONEUCT2等特异标志物表达升高[40,54-57]。该自发模型的广泛应用增进了对NEPC发生发展的理解，为NEPC潜在生物学特性的研究和治疗靶标提供了新的方向。

精准诊断及治疗NEPC离不开对其发生发展机制的研究。神经内分泌表型与CRPC的进展有关，对相关患者及PDX模型进行全基因组微阵列分析，提示同一部位神经内分泌状态和腺癌状态可能是同时存在的，CHRPC + / SYP +双重阳性可做为神经内分泌型CRPC的分子表型，且该表型不一定与AR活性有关[58]。在一项涉及18例NEPC-PDX模型的研究中，发现PSMA基因受到明显抑制，进而使得SSTR2表达上调，提示可使用PSMA作为NEPC诊断的靶向分子[59]。有研究将NEPC-PDX和腺癌之间的蛋白质组进行差异性分析，发现与神经发生、细胞周期调控和DNA修复相关的蛋白质在NEPC中均有所升高，而与线粒体功能有关的蛋白质水平则降低，同时发现转录抑制因子REST可直接调节神经元基因表达，对NEPC患者的治疗和预后较为重要[60]。

针对NEPC患者的治疗目前尚无明确有效的方案，部分原因是其分子表征较差。伊立替康（一种拓扑异构酶I抑制剂）与顺铂的联用被证明在NEPC PDX模型LTL352中具有良好的治疗效果，该方案不仅可抑制肿瘤的继续生长，还在一定程度上杀伤肿瘤细胞，减少肿瘤体积[41]。Aurora-A是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在NEPC中有明显的过表达，体内外实验及LTL352模型研究均证实NEPC对Aurora-A激酶抑制剂有高度敏感性，提示Aurora-A激酶抑制剂可单独或协助治疗NEPC和CRPC，但仍需继续进行相关临床验证[61-62]。

4 结语

综上所述，PCa PDX模型构建的理论基础与技术水平逐步趋于成熟，包括LTL在内的各大实验室正努力构建一个品系齐全的PCa PDX模型库，并逐步推进其商业化进程。从现有研究看，PDX模型在各阶段PCa的基因分析、靶标检测、药物测试和新药验证等方面均有显著作用，促进了个体化医疗的可能性，为体内研究提供了稳定可靠的载体。未来如何继续提高PDX模型的成功率、实现PDX模型批量化生产及形成完整优质产业链是值得思考的新方向。