I-tip法在海绵微生物分离培养中的应用与改进

张乙宸 张嘉凯 张桓耀 张亦弛 郝正琦

关键词：海洋动物微生物;分离;培养;I-tip技术

一、海洋动物——海绵

海洋动物有很多，其中研究比较广泛的是海绵。海绵是一种笼统的称呼，作为一种原始的多细胞动物很早便在地球上存在。淡水产和海产的海绵均存在，多数以固定落着的方式生长。海洋动物来源微生物的分离一般是采用平板分离法。平板分离法存在一定的局限性，对于这种方法，无法完美地对菌落进行分离，而且具有较高的被污染的风险。

二、两相共流法

用注射器或其他挤压设备将聚合物溶液滴入交联剂中，经固化交联形成具有一定机械强度的、稳定的水凝胶微球的方法称为锐孔法（或挤出法）。

两相共流法（Coflowing liquid stream method）：液滴形成装置的主要部件是一个直径几百微米的用于挤出悬浮细胞的海藻酸钠水溶液的针和一个直径2.5毫米的海藻酸钠管，通过这个管，挤出的溶液流人周围不相容的液体石蜡中。针被放置在同轴小管附近的上游。黏性海藻酸钠水溶液的液滴直径可以通过改变内部和外部流体的速度以及针的直径来控制，从几十微米到几百微米不等。利用300μm直径的针头，将细胞悬浮的海藻酸钠溶液以1.2cm/s的速度挤压到环境液体石蜡中，得到直径为48±8μm的cho-kl细胞包裹液滴。分裂过程不影响封闭细胞的生存能力，因为封闭过程后超过95%的cho-kl细胞仍然存活。

以上为分散相口与微球制备装置，该装置主要由毛细玻璃管（4）、针头（8）、缓冲池（5）、固定器（6）、恒流泵（2）、微量注射泵（1）等部分组成。

三、I-tip技术

I-tip技术是一种比较先进的分离培养的方法是Jung，Dawoon、Seo，Eun-Young、Epstein，Slava s.等2014年在研究海绵中微生物多样性时使用的一种技术。

I-tip技术是复刻的原位培养，我们首先取用实验室中的移取液体的滴液头，然后对滴液头进行机械切割处理，将处理好的装置嵌入到原生动物的体表内部，嵌入深度为1.25～2.25em左右为宜，滴液头的顶部用透明度较好的塑料薄膜封住，防止空气的微生物进入原位培养的培养物中感染培养液。两周之后，将所得到的分离物质接种到原生琼脂培养皿中进行下一步的分离和培养，观察所得的菌落数量和种类。

四、改进I-tip技术

在水族箱中培养海绵，用1000txL移液枪枪头端作为装置的基本元件，通过机械切片切板机床，将滴液头按照相同的规格割至1.5em，将所得的原位收取器嵌入到海绵的体表，然后所得到的新型培养液加入原位培养器中，采用胶状透明薄膜封口，处理好的微球用纳米级别的过滤膜包住，然后放入移液头里，形成有机统一的上下连接装半密封的整体。培养两周后，从每个水族箱中取出海绵和原生培养器。将收集的培养器的近宽一端用酒精处理后的机械刀片进行割片处理，再次使用微球，用微球对收集的原生培养器中的提取物再进行第二次的去离，连接方法处理完成后，使用无菌的接种环取出得到的分离溶液，接种培养到新型培养基，加入PA缓冲液进行充分的混合，在培养基底板上培养3～4周后进行观察。

五、具体实验方案

（一）试验目的

从威海近海海域取来买来海绵（多孔动物），通过对照实验，分别采用I-tip技术，微包埋法以及综合两者改进的混合方法对海绵微生物进行分离培养，探究改进后的I-tip技术是否对于筛选分离海绵微生物更加有效。

（二）采用机理

海洋微生物细胞通过具有自由进出能力的天然高分子材料包裹于通透性良好且允许氧气、营养物质和代谢产物等发育环境之中。选择良好性能的无毒无害的介质。用注射器或其他挤压设备将聚合物溶液滴入交联剂中，经盐溶液中金属阳离子的固化交联形成具有一定机械强度的、稳定的水凝胶微球。本实验采用的是海藻酸钠包埋法，一般通过ca2+固化获得海藻酸钙微球。将溶液通过针头滴入一定浓度的氯化钙溶液中，钙离子使海藻酸钠分子内部发生交联形成网格结构，形成海藻酸钙凝胶微球。通过两种方法的有机整合，形成原位生态位培养的培养容器，上宽下窄半密封式的培养条件位，更加有效的分离培养所去离的菌株，对于微生物去离和培育的研究具有的新的含义和用处。

（三）试验材料

1.样品来源

威海海域市场针海绵属海绵，少部分采用威海近海海域冲积平原和人海口处潮间带以及海底8000米深度的钙质海绵。通过直接购买或者捕捞公司海底捕捞获得，带人实验室用海水冲洗干净后放入水族箱中进行培养。

2.仪器设备

注射器，小型挤压仪器，200μL移液枪枪头，60μm～100μm玻璃珠，150μm～212μm玻璃珠，超净操作台，机械切割台。

3.试验药品

海藻酸钠溶液，氯化钙溶液，无菌PBS缓冲溶液，R2A琼脂平板，琼脂培养基，培养皿。

制备海藻酸钠溶液：取用从威海近海岸带湿的海藻，用海水清洗除杂，然后用去离子水进行2～3次冲洗，采用捣器进行细碎化处理，NaOH溶液萃取后澄清化，经氯化钙沉淀得到海藻酸钙微溶物，利用化学方法除去存在的可溶性杂质得到海藻酸沉淀，与碳酸钠作用得海藻酸钠，再经干燥和干筛后得到纯净的粉末，将制备好的粉末配置成溶液。

制备无菌PBS缓冲溶液：称取磷酸二氢钾（KH2P04）0.27g，磷酸氢二钠（Na2nP04·12H20）1.42g，氯化钠（NaCl）8g，氯化钾（KCl）0.2g，吐温-20，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。

琼脂培养基：马铃薯200g，琼脂20.0g，葡萄糖20.0g，蒸馏水1000mL。将马铃薯洗皮，切成碎块，加入煮沸20min。纱布过滤。滤液中加入葡萄糖和琼脂，加热使之溶化。再补足水量至1000mL，分装，高压灭菌23。

R2A琼脂平板通过上海齐源生物科技公司购买。

（四）试验方法

1.样品处理

将威海海域市场针海绵属海绵，少部分采用威海近海海域冲积平原和人海口处潮间带以及海底8000米深度的钙质海绵。带回实验室，放入水族箱中培养。

2.海绵微生物的分离

在水族箱中培养海绵，用1000μL移液枪枪头端作为装置的基本元件，通过机械切片切板机床，将滴液头按照相同的规格割至1.5cm，将所得的原位收取器嵌入到海绵的体表，然后所得到的新型培养液加入原位培养器中，采用胶状透明薄膜封口，处理好的微球用纳米级别的过滤膜包住，然后放入移液头里，形成有机统一的上下连接装半密封的整体。培养2周后，从每个水族箱中取出海绵和原生培养器。将收集的培养器的近宽一端用酒精处理后的机械刀片进行割片处理，再次使用微球，用微球对收集的原生培养器中的提取物再进行第二次的去离，连接方法处理完成后，使用无菌的接种环取出得到的分离溶液，接种培养到新型培养基，加入PA缓冲液进行充分混合，在培养基底板上培养3～4周后进行观察。

3.菌株的测定

将培养基上长出的菌落进行测定，采用基于分散液液微萃取技术（DLLME）的高效液相色谱法测定，得出菌落的种类，同时与对照组菌落种类，数量进行对比。

（五）预计试验结果

請列表来表示出可能获得的数据;数据处理的过程;预计的结论。

用微型观测法处理所得的原生培养菌落，观察并记录新型方法分离下，去离得到的菌落的数量大小和种类情况。（六）实验示意流程图