右美托咪定对老年小鼠剖腹探查术所致神经元凋亡的影响

吴毅 刘雅芳 张昆 王飞

术后认知功能障碍（Post⁃operative cognitive dysfunction，POCD）严重降低生活质量并与死亡率增加有关联，而神经元凋亡是导致POCD 的重要病理基础。已有研究表明老年小鼠在遭遇手术创伤后出现神经元凋亡增加与学习记忆功能手术［1］。右美托咪定（Dex）是一种高选择性α2 肾上腺素能受体激动剂，具有剂量依赖性催眠和镇静作用。右美托咪定可减轻过度的神经元炎症反应，从而减缓术后认知功能障碍的发生于发展［1］。进一步的动物研究表明，右美托咪定通过激活PGC⁃1α 途径降低氧化应激并发挥神经保护作用［3］，提示右美托咪定在认知功能障碍中具有良好的治疗作用。而右美托咪定发挥的神经保护作用是否与其抑制海马神经元凋亡有关，目前尚无相关报道。本研究拟通过对老年小鼠行剖腹探查术诱导海马神经元凋亡模型，研究右美托咪定对老年小鼠剖腹探查术所致神经元凋亡的影响，以期为防治POCD 提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 C57BL∕6 小鼠（雄性，16 月龄，28-32 g）购自广东省动物实验中心。动物所处的饲养环境为SPF 级净化空间，并可以自由地获得水和食物。在实验过程中，对动物实施的所有操作均符合动物伦理学标准。共有40 只小鼠被纳入本研究。

1.2 主要试剂与仪器 右美托咪定（江苏恒瑞）、cleaved⁃caspase 3 抗体（Abcam）、calpain 2 抗 体（Cell signaling）、Bax 抗 体（Abcam）、Bcl⁃2 抗 体（Abcam 生物技术公司）、GAPDH 抗体（Abcam）、TUNEL 荧光染色试剂盒（Promega）。

1.3 研究方法 （1）动物与分组：将40 只16 月龄的C57BL∕6 老年小鼠随机分成4 组：控制对照组（Con 组）、右美托咪定组（Dex 组）、手术组（Surgery组）、右美托咪定+手术组（Dex+Surgery 组），每组10 只。Con 组腹腔注射等体积0.9%生理盐水。

Dex 组腹腔注射25 μg∕kg 右美托咪定。Surgery 组行剖腹探查术。Dex+Surgery 组在行剖腹探查术前20 分钟预先腹腔注射25 μg∕kg 右美托咪定。手术结束后6 小时，每组各取5 只老年小鼠，使用TU⁃NEL 试剂盒检测海马各区的神经元凋亡情况。另外，在手术结束后6 小时，每组再各取5 只老年小鼠，分离出海马组织，用Western blot 法检测海马凋亡相关蛋白cleaved caspase⁃3、calpain 2、Bax、Bcl⁃2的表达情况。（2）剖腹探查术：首先我们用1.5%异氟醚复合2 升∕分钟氧气对小鼠进行麻醉。对小鼠腹部消毒后，在腹部中线作1 至2 厘米的切口。随后，对腹腔内肠和内脏等进行探查。整个手术过程在异氟醚麻醉下进行，持续时间大约30 分钟。

1.3 检测方法 TUNEL 染色首先将海马切片置于二甲苯中进行脱蜡，放入不同浓度梯度（100%，90%，70%）的酒精中各浸泡5 分钟。然后使用蛋白酶K 工作液在室温下作用10 分钟，每个切片样本中分别加入50 μl 的酶反应液于湿盒中孵育60分钟。孵育完毕后，于切片中滴加DAPI 染色液作用5 分钟后于荧光显微镜下进行拍摄。

1.4 统计学分析 所有实验数据均采用Graph⁃pad Prism 软件进行统计学分析，计量资料以（）表示。对于组间的差异采用Turkey 法进行两两比较，对于服从正态分布的计量资料，采用单因素方差分析检验。当P<0.05时被认为具有统计学差异。

2 结 果

2.1 右美托咪定减轻剖腹探查术诱导的老年小鼠海马神经元凋亡 见图1。

2.1 右美托咪定对剖腹探查术导致的老年小鼠海马cleaved caspase⁃3 表达水平的影响 见图2。

图2 右美托咪定对剖腹探查术导致的老年小鼠海马cleaved caspase⁃3 表达水平的影响

2.3 右美托咪定对剖腹探查术导致的的老年小鼠海马calpain 2 表达水平的影响 见图3。

图3 右美托咪定对剖腹探查术导致的老年小鼠海马calpain 2 表达水平的影响

2.4 右美托咪定对剖腹探查术导致的老年小鼠海马Bax 和Bcl⁃2 表达水平的影响 见图4。

图4 右美托咪定对剖腹探查术导致的老年小鼠海马Bax 和Bcl⁃2 表达水平的影响

3 讨 论

3.1 右美托咪定减轻手术所致神经元凋亡 近期的研究表明，外周手术可诱发神经炎症，导致大量神经元凋亡，从而导致学习记忆功能受损［4］。本研究通过建立老年小鼠行剖腹探查术的模型，发现右美托咪定能减轻剖腹探查术所致神经元凋亡，并且逆转剖腹探查术诱导的cleaved caspase⁃3、calpain 2 和Bax 的表达上调以及Bcl⁃2 的表达下降。

3.2 右美托咪定能发挥多种神经保护作用 最近的研究表明，右美托咪定除了众所周知的催眠和镇静作用外，还可能有其他保护作用。在阿尔兹海默症（Alzheimer's disease，AD）动物模型中，右美托咪定可以保护神经元免受变性，而此过程可能与抑制氧化应激和炎症反应有关［5］。鉴于手术可导致老龄小鼠海马神经元凋亡明显增加，本研究主要探讨右美托咪定在手术诱导的老龄小鼠海马神经元凋亡模型中的作用。

3.3 手术创伤可导致神经元凋亡 手术创伤可导致细胞内Ca2+浓度增加，而细胞内Ca2+浓度增加可使凋亡信号通路激活，进一步导致神经元凋亡。目前，已有研究结果表明细胞凋亡和calpain 2之间有着密切的关联［6］。本研究发现剖腹探查术导致老年小鼠海马组织TUNEL 阳性细胞数明显升高，并且上调cleaved caspase⁃3 和calpain 2 的表达，提示手术创伤可同时激活caspase⁃3 依赖和非cas⁃pase⁃3 依赖的信号通路导致神经元凋亡。

3.4 右美托咪定通过降低Bax/Bcl⁃2 比例减轻神经元凋亡 在AD 动物模型中，当神经元过表达Bcl⁃2 时，凋亡细胞显著减少［7］。与以前的研究一致，我们发现手术导致的神经元凋亡与Bcl⁃2 表达减少以及Bax∕Bcl⁃2 比例增加有关，右美托咪定通过增加Bcl⁃2 表达以及降低Bax∕Bcl⁃2 比例来减轻手术所导致的海马神经元凋亡，并且可以通过稳定促凋亡蛋白来减轻线粒体孔损伤，从而减少其对线粒体膜通透性转运的有害影响。

本研究通过建立剖腹探查术诱导老年小鼠海马神经元凋亡模型，并在手术前使用右美托咪定预处理，发现右美托咪定预处理能通过减轻手术所导致的cleaved caspase⁃3 和calpain 2 表达增加以及Bax∕Bcl⁃2 比值增加，并且明显减轻剖腹探查术所导致的老年小鼠海马神经元凋亡。总体来说，本研究结果为揭示手术导致的神经元凋亡机制以及防治策略提供新的思路。