冬凌草甲素抗食管鳞癌转录的组学研究

王 伟，丁 爽，龚美源，李娜娜，燕迪迪，倪凯园，郭建成, 张 旗

1)郑州大学第一附属医院肿瘤科 郑州 450052 2)郑州大学药学院 郑州 450001 3)省部共建食管癌防治国家重点实验室 郑州 450052 4)郑州大学精准医学中心 郑州 450052

食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，居我国癌症死因的第4位[1]。食管癌发病具有明显的地区特异性，高发区域为我国太行山南部的河南、山西和河北三省交界地区及广东的潮汕地区。尽管食管癌综合治疗不断发展，但其5 a生存率仍不足20%[2]。因此，开发新型食管癌治疗药物是临床研究的迫切需要和重要方向之一。冬凌草是我国传统中药，临床实践显示其对多种恶性肿瘤治疗有效，尤其对肺癌等多种常见肿瘤的抑瘤率高达41%。冬凌草对我国北方发病率较高的食管癌和胃癌尤为敏感[3]，冬凌草甲素是冬凌草抗癌的主要活性成分[4]。

为进一步阐明冬凌草甲素抗食管癌作用可能的分子机制，我们运用了全转录组分析技术(RNA-seq)分析冬凌草甲素处理4 h后的食管癌细胞中转录组的变化，探讨冬凌草甲素抗食管癌的潜在分子靶点。

1 材料与方法

1.1 药品和主要试剂冬凌草甲素(批号T12D7F26645)分析标准品，HPLC≥98%，购于上海源叶生物科技有限公司。DMSO购自Solarbio公司，MTT购自Amresco公司，FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit购于美国Illumina公司，反转录试剂盒(RR036A)由日本TaKaRa公司提供，SYBR qPCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司，RNA提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司。

1.2 冬凌草甲素对EC109、TE1细胞增殖和凋亡影响的检测

1.2.1MTT法检测细胞增殖情况 取对数生长期的EC109和TE1细胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按5 000个/mL的密度分别接种于96孔板，每孔100 μL 细胞悬液。常规培养12 h后，弃培养基，分别加入0、10、20、40、80、160 μmol/L冬凌草甲素，每孔200 μL，每个浓度设3个复孔。于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中分别培养24、48、72 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，37 ℃避光孵育4 h，取出96孔板，弃去培养基，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min使结晶物充分溶解，用全自动酶标仪检测570 nm波长下的吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=(1-实验A值/对照A值) ×100%。

1.2.2流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数生长期的EC109和TE1 细胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按4×105个/孔的密度接种于6孔板中，置于CO2培养箱中培养12 h，待细胞贴壁后弃原培养基，每孔分别加入冬凌草甲素终浓度为0、10、20和40 μmol/L的培养基2 mL培养，每组设3个复孔。培养24 h后用2.5 g/L胰蛋白酶(不含EDTA)消化细胞，用PBS洗涤2次后(1 000 r/min，5 min)，加入500 μL Binding buffer悬浮细胞，再加入Annexin V和PI各5 μL混匀，室温避光反应15 min，1 h内上流式细胞仪检测。

1.3 RNA-seq建库、测序分析取对数生长期的细胞接种于6孔板，过夜贴壁后，加入30 μmol/L的冬凌草甲素。4 h后按照试剂盒说明提取总RNA，按照Illumina链特异RNA文库试剂盒构建RNA文库。取2 μg RNA，用PolyT磁珠对mRNA富集，片段化后进行第一链和第二链cDNA合成，然后末端加A，并加上特异性标签(index)。对文库进行PCR扩增后，在Illumina Hiseq4000平台上进行测序。

转录组数据分析：首先使用FastQC和Qualimap软件对转录组数据进行质量控制，根据FastQC结果进行数据处理，过滤掉低质量的测序数据以及比对到核糖体RNA的读段(reads)。基因组比对及后续处理步骤参考“A survey of best practices for RNA-seq data analysis”进行。使用STAR软件将质量合格的高通量测序数据比对到人类参考基因组(GRCh37)上，RNA-seq序列的比对用于鉴定表达的基因及其定量，并有助于发现可变剪切和新的转录本。随后分别使用Salmon软件和FeatureCounts软件对基因转录水平进行定量，得到基因表达的counts数据和TPM值，用于后续的差异表达基因分析等。采用BcbioRNA-seq R包进行差异基因表达分析。

1.4 统计学处理应用SPSS 21.0分析。不同浓度冬凌草甲素处理不同时间对EC109和TE1细胞抑制率的影响采用6×3析因设计的方差分析，不同浓度冬凌草甲素对EC109和TE1细胞凋亡的影响采用单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 冬凌草甲素对EC109和TE1细胞增殖的影响冬凌草甲素对EC109和TE1细胞的增殖均有抑制作用，呈浓度依赖性和时间依赖性。结果见表1、2。

表1 不同浓度冬凌草甲素作用不同时间对EC109细胞增殖抑制率的影响(n=3) %

表2 不同浓度冬凌草甲素作用不同时间对TE1细胞增殖抑制率的影响(n=3) %

2.2 冬凌草甲素对EC109和TE1细胞凋亡的影响冬凌草甲素可促进EC109和TE1细胞凋亡，结果见表3。

表3 不同浓度冬凌草甲素对EC109和TE1细胞凋亡率的影响(n=3) %

2.3 基因差异表达分析结果见图1。在TE1细胞中冬凌草甲素可使2 023个基因表达上调，1 642个基因下调；而在EC109细胞中冬凌草甲素可使463个基因表达上调，419个基因下调；其中，共同上调的基因为284个，共同下调的基因为176个。

上:上调基因；下:下调基因

2.4 冬凌草甲素诱导细胞转录组变化结果见图2、3。RNA-seq结果显示，冬凌草甲素可以诱导谷胱甘肽合成和再生相关基因以及ROS相关的SLC7A11、TRIM16、TXNRD1、SRXN1、GCLM、GCLC、SLC3A2 以及热激反应基因HSPA1A、HSPA1B、HSPH1、BAG3、 DNAJB1、 HSPA8、 HSP90AA1、DNAJA1和DNAJA4表达升高。

图2 冬凌草甲素诱导细胞转录组变化的散点图

图3 冬凌草甲素诱导EC109和TE1细胞的差异基因热图

2.5 冬凌草甲素诱导细胞转录组变化的GO聚类分析结果见图4、5。GO聚类分析显示，差异表达基因的功能为热激反应基因、蛋白错误折叠相关基因、神经投射发生基因。其中HSP90AB1和HSP90AA1在这三类功能基因中发挥重要作用。

图4 冬凌草甲素诱导TE-1和EC109共同上调基因的GO聚类分析柱状图

图5 冬凌草甲素诱导TE-1和EC109共同上调基因的GO聚类分析图

3 讨论

冬凌草甲素具有明确的抗肿瘤作用，但由于其作用的分子机制尚未完全阐明，限制了冬凌草甲素这一类化合物在临床中进一步应用。近年来，随着分子药理技术的不断发展，冬凌草甲素相关的抗肿瘤分子靶点变得越来越明晰。

冬凌草甲素作用的分子靶点为HSP70且它能直接和HSP70半胱氨酸结合来抑制HSP70活性[5]。He等[6]发现冬凌草甲素能直接与NLRP3半胱氨酸酸的巯基结合，通过NLRP3来抑制炎症反应。Song等[7]发现冬凌草甲素能抑制AKT活性。Sechet等[8]发现冬凌草甲素能激活EFGR。除此之外，研究[9-10]认为冬凌草甲素作用的分子靶向信号通路分别为NF-κB和mTOR等。冬凌草甲素对多个蛋白半胱氨酸上的巯基有反应活性，而且冬凌草甲素对多个细胞信号通路均有抑制作用，为了从整体水平探索冬凌草甲素抗肿瘤活性的分子机制，作者通过组学分析来阐明冬凌草甲素抗肿瘤作用的潜在分子靶点。

RNA-seq是一项基于二代测序技术的全新分析技术，其基本原理是对转录组RNA进行大规模平行测序，通过大数据分析对全部的RNA进行定性和定量分析。这一技术显著优于传统芯片技术，在定性和定量方面均具有巨大优势。由于转录因子HSF1调控HSPA1A、HSPA1B、BAG3、HSPH1、DNAJB1、HSPA8、HSP90AA1、DNAJA4和DNAJA1等基因表达水平，冬凌草甲素处理后上述基因表达升高，提示冬凌草甲素可通过激活HSF1发挥作用。在正常情况下，HSP70与HSF1结合后可抑制HSF1的转录活性。而冬凌草甲素与HSP70结合使得HSF1脱抑制，从而导致转录活性显著增高[11]。因此，我们推测HSP70可能是冬凌草素作用的重要分子靶点。冬凌草甲素还可与多种蛋白的半胱氨酸结合，从而造成蛋白错误折叠和诱发热激反应。此外，冬凌草甲素诱发GSH生成系统中多种酶和蛋白的mRNA水平升高，提示冬凌草甲素可能是通过耗竭细胞内的GSH来发挥作用。研究[11]也证实，GSH能完全阻断冬凌草甲素的抗癌活性，而GSSG则没有此作用，表明GSH中的巯基可能直接参与了冬凌草甲素的抗癌作用。

综上所述，冬凌草甲素作用后可导致食管癌细胞内GSH密切相关基因SLC7A11、TRIM16、TXNRD1、SRXN1、GCLM、GCLC、SLC3A2水平升高，细胞内的GSH耗竭可能是冬凌草甲素抗食管癌作用最为重要的分子机制之一。