乙型肝炎病毒核酸免提取荧光定量PCR方法应用价值分析

刘丽 营口经济技术开发区中心医院（营口市第六人民医院） （辽宁 营口 115007）

内容提要： 目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）核酸免提取荧光定量PCR方法应用价值。方法：选择于2017年7月～2019年7月本院收治的乙型肝炎病毒感染患者145例作为资料，均取血清提取DNA，采用ELISA（酶联免疫-吸附剂测定）法测定HBV血清标记物，采用荧光定量PCR检测血清HBV-DNA，比较两种方法检测结果。结果：ELISA法测定结果为HBeAg（+）/HBeAg（-）94例、HBeAg（-）/HBeAg（+）42例、HBeAg（-）/HBeAg（-）9例，荧光定量PCR相对应阳性率分别为100.0%、64.29%、33.33%，不同HBV血清标记物的阳性率比较差异显著，P＜0.05。结论：在乙型肝炎病毒核酸检测中采用荧光定量PCR法可实现定量计数，准确反应核酸复制状况，为诊治提供可靠依据，保证治疗合理性，应用价值较高。

乙型肝炎在我国较为多见，主要是由于乙型肝炎病毒引起的以肝脏病变为主的感染性疾病，可能导致出现乏力疲劳、食欲不振等症状，持续发展易引起多器官损害[1]。近年来我国乙型肝炎感染率逐渐增加，为实现对乙型肝炎的尽早发现，需重视实验室对乙型感染病毒的检测。常规多采用ELISA法测定HBV血清标记物进行诊断，但存在明显局限性。而随着科技进步，如今荧光定量PCR法受到重视，其具有特异性强、自动化程度高优势，可直接呈现HBV复制过程[2]。为此，本次研究对乙型肝炎病毒核酸免提取荧光定量PCR方法应用价值进行了探讨，分析如下。

1.资料与方法

1.1 临床资料

选择于2017年7月～2019年7月本院收治的乙型肝炎病毒感染患者145例作为资料，均知晓本次研究内容及目的，且自愿签署知情同意书。其中男性78例，女性67例，年龄22～60岁，平均（40.17±3.74）岁。排除严重黄疸症状患者、凝血功能障碍患者等[3]。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法。取空腹外周静脉血5mL作为标本，离心处理10min，速度为3000r/min，分离上清血液，置入-20°C环境保存，采用ELISA法测定HBV血清标记物，北京万泰生物药业有限公司提供试剂盒，酶标仪型号为HBS1096B，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.2荧光定量PCR法。取待测血清样本100μL，离心处理10min，1000r/min，分离上清血液加入100μlDNA提取液Ⅰ，混匀后离心处理10min，1000r/min，去除上清液，在沉淀物中加入25μlDNA提取液Ⅱ，混匀后沸水浴10min，离心处理10min，1000r/min，取上清液。在离心管中加重37.6μlPCR反应液，0.4μlTaq酶、0.06μL尿苷酶作为反应管，加入2mL处理样本、对照品，对照品浓度梯度108copies/mL，107copies/mL，1076copies/mL，105copies/mL，104copies/mL，103copies/mL。完成后进行检测，采用核酸扩增仪进行PCR扩增。设置激发光波长487rim，检测波长525nm，探针在扩增区中间，条件为93°C预变形2s，94°C预变形5s，60°C预变形30s，40个循环。探针HB-Taq S，引物5'-ACATCAGGATTCCTAGGACC-3'（nt167-nt186）；探针HB-Taq AS，引物5'-GGTGAGTGATTGGAGGTTG-3'（nt339-nt321）；探针HB-TaqP，引物5'-FAM-CAGAGTCTAGACTC GTGGTGGTGGACTTC-3'（nt242-nt267）；探针HB-C-S，引物5'-CCTGCACCGAACATGGAGAG-3'（nt143-nt162）；探针HB-C-AS，引物5'-ATATGATAAACGCCGCAGACAC-3'（nt401-nt379）。

1.3 观察指标

比较两种方法的检测结果。

1.4 统计学分析

采用统计学软件SPSS20.0进行处理，计量资料以%表示，采用χ2检验，P＜0.05为比较差异有统计学意义。

2.结果

分析表1可知，ELISA法测定结果为HBeAg（+）/HBeAg（-）94例、HBeAg（-）/HBeAg（+）42例、HBeAg（-）/HBeAg（-）9例，荧光定量PCR相对应阳性率分别为100.0%、64.29%、33.33%，不同HBV血清标记物的阳性率比较差异显著，P＜0.05。

表1 两种方法的检测结果分析

3.讨论

根据临床研究可知，肝炎主要致病因素为乙型肝炎病毒，其作为DNA病毒，对人体有易感性，可引发乙型病毒性感染，在我国较为多见，且呈现逐渐增长趋势[4,5]。如今我国部分乙型肝炎患者形成持久免疫力，成为慢性感染患者，但大多数患者发展为肝硬化及肝癌，因此需重视对乙型肝炎的尽早检出，有效治疗，控制病情进展[6]。ELISA法属于检测乙型肝炎病毒的常见手段，可间接反应病毒的表达和复制。为进一步提高准确率，近年来临床加强对荧光定量PCR法的应用，其可检测血清学指标阴性的突变株DNA，弥补ELISA法检测不足[7]。本次研究结果显示ELISA法测定结果为HBeAg（+）/HBeAg（-）94例、HBeAg（-）/HBeAg（+）42例、HBeAg（-）/HBeAg（-）9例，荧光定量PCR相对应阳性率分别为100.0%、64.29%、33.33%，不同HBV血清标记物的阳性率比较差异显著，P＜0.05，提示荧光定量PCR法可在阴性标本中检测出感染病毒，并可实现对HBV-DNA复制定量计数，准确反应感染情况，应用价值较高。

综上所述，乙型肝炎病毒核酸免提取荧光定量PCR方法应用可实现对病毒感染进展及抗病毒治疗反应的判断。