侵染葫芦科作物的甜瓜黄斑病毒研究进展

郭静依 肖春雷 符启位 罗丰

摘 要：甜瓜黄斑病毒（Melon yellow spot orthotospovirus，MYSV）为番茄斑萎病毒科（Tospoviridae）正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus）病毒，于1992年首次发现于日本的甜瓜种植基地。目前，该病毒在世界多个国家及我国多个省份均有报道，对甜瓜和黄瓜等葫芦科作物的生产造成较大威胁。以MYSV的发生和分布、基因组结构和功能、传播方式和媒介、检测方法以及防控对策为重点，系统综述了MYSV的研究进展，探讨了今后在该病毒致病机制、与寄主互作机制以及抗病育种等方面的研究重点，以期为该病毒的研究和防治提供参考。

关键词：甜瓜;甜瓜黄斑病毒;正番茄斑萎病毒属;葫芦科作物;防控

中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）08-001-06

Advances in Cucurbit crop virus disease caused by Melon yellow spot orthotospovirus

GUO Jingyi， XIAO Chunlei， FU Qiwei， LUO Feng

（Sanya Sci-Tech Academy of Hainan National Breeding and Multiplication， Sanya 572000， Hainan， China）

Abstract： Melon yellow spot orthotospovirus（MYSV）， a virus belonging to the family Tospoviridae， the genus Orthotospovirus， was firstly found on netted melon （Cucumis melo L.） in Shizuoka prefecture in Japan. Currently， MYSV has been found in many countries including China， and has been bringing considerable damage to Cucurbit crops like melon and cucumber， etc.. This article reviews the distribution， genome structure and function， transmission and vector， detection and control method of MYSV. In addition ， the future prospect for research on pathogenicity of MYSV， virus-vector-host interaction and MYSV-resistance breeding is also discussed.

Key words： Melon; Melon yellow spot orthotospovirus; Orthotospovirus; Cucurbit crops; Control

世界范圍内，植物病毒每年造成的经济损失超过300亿美元[1]。葫芦科作物在热带、亚热带及温带地区均有广泛种植，在农业生产中具有相当重要的地位[2]。目前已知的侵染葫芦科作物的病毒有125种，而近年来报道较多的侵染葫芦科作物的甜瓜黄斑病毒（melon yellow spot orthotospovirus，MYSV）为布尼亚病毒目（Bunyavirales）番茄斑萎病毒科（Tospoviridae）正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus）[3]新发现的一种病毒。该病毒的侵染可造成葫芦科作物花叶、黄化、畸形或坏死等典型病毒病症状，并且还可影响果实外观、品质和产量，给种植者造成经济损失。笔者围绕MYSV的发生分布、基因组结构功能、传播媒介、检测手段和防控对策等，系统探讨了该病毒病害的研究进展，以期为该病毒的研究和防治提供参考。

1 MYSV的发生、分布和危害

甜瓜黄斑病毒的发现可追溯到20世纪90年代初。1992年，在日本静冈县的甜瓜（Cucumis melo L.）种植基地发生了严重的病害，染病的甜瓜叶片首先表现出明脉和斑驳，而后逐渐出现黄化和坏死斑等典型病毒病症状，并造成果实斑驳，严重影响甜瓜品质[4]。经研究确认，该病是由一种新的植物病毒引起，根据国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）的命名规则，这一病毒被命名为甜瓜黄斑病毒[5]。随后，研究人员在黄瓜和苦瓜上也发现了该病毒[6-7]。此外，泰国和厄瓜多尔等国在西瓜、甜瓜、黄瓜、丝瓜和南瓜等葫芦科作物上同样也陆续检测出MYSV[8-11]。而在我国，自2006年以来，MYSV于台湾相继在西瓜[12]和黄瓜[13]上被发现。2009年，Gu等[14]在海南省三亚市的甜瓜上检测到了一种新发病毒，经分子检测确认其病原为MYSV，与台湾省分离物核苷酸相似性达99%。而后，该病毒也在海南黄瓜上被检测到[15]。2019—2020年笔者调研发现，MYSV在海南三亚发生率极高，在一些黄瓜产区其感染率可达100%（未发表数据）。迄今为止，我国广东、广西和山东等地也有MYSV的报道，其发病率高，并有逐步扩散的趋势[16-19]。

2 MYSV颗粒形态、基因组结构和进化分析，以及各蛋白功能

2.1 MYSV形态特征

对被侵染叶片样本进行电镜观察发现，MYSV同其他正番茄斑萎病毒属的病毒一样为类球形包膜结构粒子，其病毒颗粒大量散布于细胞之中，直径介于70～135 nm之间[4，20]。除此之外，在MYSV侵染的叶片中同样可观察到平行膜（parallel membranes，PPM）、病毒质（viroplasm，VP）和病毒双层包膜颗粒（double-enveloped particle，DEP）等典型结构。对不同MYSV侵染阶段植物叶片的研究发现，细胞各侵染阶段有且仅有DEP被发现，未见病毒单膜颗粒（single-enveloped particle，SEP）[5]。

2.2 MYSV基因组结构及进化分析

Kato等[5]通过对MYSV分子特征的分析，确认MYSV与正番茄斑萎病毒属的其他病毒相同，其病毒颗粒包含3条线形单链RNA，分别为L RNA、M RNA和S RNA。其中L RNA为负义，长度为8918 nt[21];而M RNA和S RNA均为双义，根据病毒变种的不同，长度分别介于4815～4835 nt和3232～3257 nt之间。该病毒各基因组片段3端和5端区域均具有高度保守的碱基，且互补形成锅柄状结构[17，22-24]。MYSV的L RNA拥有一个开放阅读框（open reading frame，ORF），在病毒互补链上编码一个依赖于RNA的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp），与其他布尼亚病毒目病毒的RdRp具有共同的序列高度保守区。此外，L RNA的5端和3端的互补区与其他非编码区序列均表现出正番茄斑萎病毒属的高度保守性[21]。Okuda等[22]研究发现，MYSV的M RNA共有2个ORF，分别位于其病毒链和互补链上。其中，病毒链的ORF编码非结构蛋白（nonstructural protein）NSm，大小为33.99 kDa;而互补链则编码Gn/Gc前体蛋白Gp，大小为124.08 kDa。MYSV S RNA的病毒链和互补链同样包含2个ORF。位于S RNA 5端的ORF编码大小为53.1 kDa的蛋白，经分析确认其为MYSV的非结构蛋白NSs。而位于S RNA互补链3端的ORF编码大小为31.0 kDa的蛋白，为MYSV的核衣壳蛋白（nucleocapsid protein）N[23-24]。MYSV非结构蛋白NSs序列包含一段大小为847 bp的富含AU的基因间区段，而核衣壳蛋白序列包含8个碱基对的保守序列（5-AUUGCUCU-3），这与已报道的其他正番茄斑萎病毒属的S RNA基因结构类似[23，25]。进一步对亲缘关系进行分析，显示MYSV与西瓜银斑驳病毒（Watermelon silver mottle virus，WSMoV）和花生芽坏死病毒（Groundnut bud necrosis virus，GBNV）的L RNA序列、Gp及NSm基因具有较高的相似性，属于同一个进化支系[22]。

根据已公布的核苷酸序列分析，显示MYSV各分离物的亲缘分组与寄主的关系不大，而与地域的关系相对较大[24，26]。其中泰国分离物的多样性最为丰富，其次为日本分离物[27]。不过由于目前国内外对MYSV的研究相对较少，可供分析的核苷酸序列不多，这些推断仍需要更多的數据支持。

2.3 MYSV各蛋白功能

目前对于MYSV各蛋白的研究尚未见报道，但正番茄斑萎病毒属中这些蛋白的功能已较为明确。其中，RdRp主要负责病毒基因组的复制和转录，是最小侵染单位的病毒核酸蛋白复合体（ribonucleocapsid，RNP）的重要组分之一[28-30]。RdRp也可参与病毒和昆虫介体的互作，如番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）的RdRp可与其昆虫介体西花蓟马（Frankliniella occidentalis）的转录因子FoTF（F. occidentalis putative transcription factor）结合，促进病毒在蓟马体内的复制，但对病毒的转录无影响[31]。病毒的糖蛋白前体蛋白Gp可经寄主因子切割后产生Gn和Gc，它们参与病毒的组装，且对昆虫介体的获毒和传毒十分重要[32-33]。作为移动蛋白，非结构蛋白NSm作用于胞间连丝和内质网，负责病毒在寄主的胞间运动[34-35]。S RNA编码的非结构蛋白NSs为病毒的RNA静默抑制蛋白（RNA silencing supressor protein），负责对抗病毒植物寄主的免疫系统[36]。另有研究表明，TSWV NSs在西花蓟马中同样具有RNA静默抑制作用，NSs功能的缺失会影响TSWV在昆虫介体内的积累，从而使带毒昆虫不具备传毒能力[37]。而同为RNPs的重要组成部分，病毒核衣壳蛋白N参与正番茄斑萎病毒属病毒的多种生物学过程，如早期病毒RNA的合成以及病毒颗粒的组装和成熟等[38-39]。

3 MYSV传播媒介

3.1 MYSV昆虫介体

同其他许多正番茄斑萎病毒属的病毒一样，MYSV可以通过摩擦接种和蓟马传播。Kato等[4]在调研MYSV侵染的甜瓜后认为棕榈蓟马（Thrip palmi Karny）可能是该病毒的昆虫介体，后经单次和序贯检定证实了该假设。

棕榈蓟马又称节瓜蓟马、棕黄蓟马或瓜蓟马，属缨翅目（Thysanoptera）蓟马科（Thripidae），喜食葫芦科等蔬菜作物[19]。研究发现，棕榈蓟马以持久性增殖方式传播MYSV，其对病毒的获取主要发生于一龄幼虫期，而传毒则发生于成虫期，且携带MYSV的棕榈蓟马成虫的传毒能力至少可持续7 d[4]。代惠洁等[19]进一步研究发现，带毒棕榈蓟马成虫在健康黄瓜植株上取食48 h感病株率达到53.33%，且黄瓜植株中MYSV感病株率随着带毒棕榈蓟马取食时间的延长和种群数量的增加而呈明显上升趋势。与同一科的许多病毒对蓟马表现出的间接影响不同，MYSV感染后的黄瓜植株对棕榈蓟马的取食、生长发育和生殖的影响并不显著[40]。

3.2 MYSV杂草中间宿主

Kato等[4]测试了22个科共68种植物，发现MYSV寄主范围狭窄，仅对葫芦科作物有很强的侵染能力。考虑到田间杂草可能是MYSV的重要中间寄主，研究人员对黄瓜种植区周边9个科共19种杂草进行调查，结果显示MYSV可侵染7个科共13种杂草。其中，在苦苣菜（Sonchus oleraceus L.）和小蓬草（Erigeron canadensis L.）上可见明脉，球序卷耳（Cerastium glomeratum Thuill.）则表现出斑驳，而其他杂草上虽检测出MYSV但未观察到病征。进一步研究确认宝盖草（Lamium amplexicaule L.）、铁苋菜（Acalypha australis L.）和球序卷耳为棕榈蓟马成虫的杂草寄主[41-42]。试验显示，使用带毒黄瓜植株饲养的棕榈蓟马可通过取食将MYSV传给宝盖草和球序卷耳。尽管这2种杂草均不显示侵染症状，球序卷耳表现出与黄瓜类似的被侵染率，而棕榈蓟马对宝盖草有较强的取食偏好。值得注意的是，虽然使用带毒球序卷耳饲养的棕榈蓟马可以将MYSV传播给黄瓜幼苗，但侵染率较低，而使用带毒宝盖草饲养的棕榈蓟马则无法将MYSV传播至黄瓜幼苗[42]。

4 MYSV检测方法

目前，MYSV的检测主要有血清学分析和分子生物学检测2种方法。血清学分析显示，MYSV的核衣壳蛋白和非结构蛋白NSs与WSMoV血清组病毒拥有共同抗原表位[13]。使用MYSV核衣壳蛋白单克隆抗体、兔抗WSMoV核衣壳蛋白血清以及WSMoV血清组非结构蛋白NSs单克隆抗体可有效检测MYSV，但核衣壳蛋白多克隆抗体难以区分MYSV与其他WSMoV血清组病毒[12-13，43]。石川等[44]使用胃蛋白酶对MYSV抗体进行片段化处理，采用F（ab）2片段设计MYSV的三抗体夹心法（triple antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay，TAS-ELISA），其灵敏度高出双抗体夹心法（double antibody sandwich ELISA，DAS-ELISA）约16倍。Wiboonchotikorn等[45]制备了MYSV非结构蛋白NSs多克隆抗体，在硝酸纤维素膜-酶联免疫吸附法（nitrocellulose membrane-based ELISA，NCM-ELISA）检测中对MYSV感染的黄瓜和甜瓜样本表现出专一性，但该抗体在使用抗原直接包被酶联免疫吸附法（direct antigen-coating ELISA，DAC-ELISA）时并未成功鉴别田间MYSV侵染样品。櫛間[46]改良了斑点免疫结合分析法（dot immuno-binding assay，DIBA），使用能够重复利用的抗体混合液快速准确地对田间MYSV疑似样本进行检测。除此之外，研究人员还建立了简单易行的MYSV的微球免疫检测法（microsphere immunoassay，MIA），使用MYSV单克隆抗体包被的微球和藻红蛋白（R-Phycoerythrin，R-PE）标记二抗（多克隆抗体）可对田间MYSV的单一和复合侵染进行检测。相比ELISA和RT-PCR检测，MIA的相对准确度和相对特异性可达99%和100%[47-48]。

分子生物学检测目前多以MYSV的S RNA序列保守区如核衣壳蛋白序列等设计引物，使用RT-PCR检测MYSV侵染[26，43，49-52]。也可依据正番茄斑萎病毒属M和L RNA的序列特征设计引物，检测和鉴别MYSV及其他正番茄斑萎病毒属病毒[53]。此外，下元祥史等[54]依据MYSV核衣壳蛋白序列设計并完善了MYSV的PCR微孔板杂交检测技术（PCR-microplate hybridization，PCR-MPH），通过测试发现，PCR-MPH法检测植物样品中的MYSV敏感度高于ELISA法和RT-PCR法625倍;对于单个棕榈蓟马中MYSV的检测，PCR-MPH的检测灵敏度也高于RT-PCR法。

相比RT-PCR，恒温扩增的逆转录环介导等温核酸扩增技术（reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）更为快速简便，同样可用于检测MYSV。桑原和酒井[55]依据核衣壳蛋白序列设计出MYSV的RT-LAMP检测方法，可不经过RNA提取直接对疑似MYSV染病叶片研磨液进行检测。Zeng等[56]和李战彪等[57]同样根据MYSV的核衣壳蛋白序列设计RT-LAMP引物并优化反应条件，建立了MYSV的RT-LAMP快速检测鉴定方法，其检测灵敏度较RT-PCR高100倍。

结合使用分子和血清学技术，研究人员还探究了基因扩增产物的固相杂交-酶联显色法（RT-PCR-ELISA）检测MYSV的方法。该方法使用地高辛（digoxigenin，DIG）标记的病毒特异性探针引物与病毒核衣壳蛋白RT-PCR扩增产物杂交后进行ELISA反应，可检测并区分MYSV及其他3种WSMoV血清组病毒。该方法较RT-PCR法拥有更高的检测灵敏度（10～1000倍）[58]。

5 MYSV防治手段

5.1 MYSV的农业防治

与其他许多植物病毒一样，昆虫介体在MYSV的传播中有着极其重要的作用。因此，棕榈蓟马的防控是MYSV防治中的关键之一。使用化学药剂是防治棕榈蓟马的有效方法，但考虑到棕榈蓟马的抗药性[59]，应结合使用栽培和物理、生物防治方法。研究发现采用设施栽培，定植前及时清除设施周边杂草能有效预防MYSV[42]。根据蓟马的趋向性，可使用蓝色粘板诱捕棕榈蓟马[41]，或采用红光进行趋避[60-61]。而对带毒棕榈蓟马趋避性的研究目前尚未见报道。

对几种葫芦科作物的调查显示，在MYSV和WSMoV共同出现的地块多见单一病毒侵染的现象，极少发生MYSV和WSMoV的共同侵染，这可能是诱导交叉免疫保护导致的[13，62]。测试发现，使用人工诱变分离出的MYSV弱毒株SA08-8接种黄瓜可诱导其产生对MYSV强毒株的免疫抗性，从而减轻MYSV对黄瓜的侵害[63]。

5.2 MYSV抗病品种选育

培育和选择抗病品种是防治植物病毒病的有效方法。MYSV严重威胁着葫芦科作物的安全生产，近10年来，日本学者主要围绕黄瓜开展了该病毒抗病品种的选育工作[64]。研究人员测试了398份黄瓜育种材料，发现来自南亚和东南亚等地的13份材料表现出了对MYSV的抗性，其中，Yamakyuri-1和27028930分别对黄瓜分离株系MYSV-FuCu05P和甜瓜分离株系MYSV-S具有抗性[65]。应用SSR标记和QTLs定位对抗MYSV材料的研究发现，27028930对株系MYSV-S的抗性位于3号染色体。而27028930对株系MYSV-FuCu05P的抗性符合数量遗传，其主效QTL位于1号和3号染色体，微效QTL位于7号染色体[66]。目前，依据27028930黄瓜材料培育出黄瓜中间母本農7号并选育出具有中等程度MYSV抗病性的品种安濃4号[67-68]。值得注意的是，无论Yamakyuri-1还是27028930的抗病性均依赖于温度，气温较高时其抗病效果受到限制[69]。而当前我国尚无MYSV抗性瓜类种质鉴定的报道。

6 小結与展望

葫芦科包含多种重要的经济作物，鉴于MYSV对葫芦科作物的危害及其较高的发病率，为保障作物安全生产，MYSV的相关研究应引起足够的重视。为更好地防控MYSV，了解病毒的特性、明确病毒的致病机制及其与植物和昆虫寄主的互作机制是关键。现阶段，MYSV的基因组功能和致病机制等大多是与同属其他成员对比后得出的。由此，应收集、分离和鉴定不同MYSV分离物，并对其基因组结构和功能进行更为深入的研究，特别是要明确MYSV的致病和沉默抑制相关机制，以期找到有效防控该病毒的突破点。作为MYSV的昆虫介体，棕榈蓟马在MYSV的传播中起到了至关重要的作用，但目前对棕榈蓟马与MYSV的互作机制，特别是MYSV感染对棕榈蓟马行为的影响以及棕榈蓟马对MYSV的传毒特征的研究尚不深入。此外，目前的研究尚未揭示MYSV的杂草寄主种类及其在MYSV侵染循环中的作用。由此，加深对MYSV与其植物和昆虫寄主互作方面的研究对控制MYSV的传播具有重要的实践意义。与其他措施相比，使用抗病品种对植物病毒病的防治更为经济有效，且由于能减少施用化学药剂，更有利于保护生态环境。当前对抗MYSV种质资源以及抗性遗传的研究较少，应加快对MYSV抗性种质的鉴定、抗性分子标记的开发和植物抗MYSV病的分子机制等的研究，根据不同区域MYSV株系及气候环境需求，选育出综合性状优良的抗MYSV品种，以减少MYSV带来的经济损失。

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