二氧化氯消毒剂在开放式组培中应用试验初探

杨静 张怡 何素芬 李雪 曹巧玲 王振

摘要：植物組织培养过程中，灭菌与消毒是防止微生物污染最基本的、最重要的环节，也是组培成功与否的关键因素之一。本试验以香石竹为培养材料，选用必洁仕牌二氧化氯消毒剂，对培养瓶、房间和外植体进行消毒杀菌，再进行接种培养，观察其消毒杀菌效果，以及对外植体分化效果，为二氧化氯消毒剂应用于植物组培快繁提供试验数据，供同行们参考。

关键词：二氧化氯 消毒剂 香石竹 开放式组培

在植物组织培养过程中，防止和消除细菌、真菌及其他微生物的感染，除了培养基、培养瓶、接种工具用品必须严格消毒外，外植体表面消毒处理是非常重要的一环，也是外植体材料从带菌状态转为无菌状态的关键步骤。目前植物组培中最常用的消毒剂为氯化汞和次氯酸钠等，汞为重金属元素，对环境和人体都有极大的负面影响，同时国家严禁汞消毒废液排入下水道，无害化处理操作繁琐。次氯酸钠杀菌效果常因植物种类不同，同一植物取材部位、取材时间不同而不同。我们以必洁仕牌二氧化氯消毒剂替代升汞和次氯酸钠产品，在花卉香石竹组培过程中，用于外植体消毒试验探索，取得了一定的效果，但由于试验次数有限，试验结果仅供同行参考。

1.试验材料与方法

1.1试验材料

香石竹茎段：选择剪取当年生长健壮无病虫害感染的香石竹茎干，剪掉叶片，再剪成带两个叶节的茎段。

1.2药剂与用品

必洁仕牌二氧化氯消毒剂、次氯酸钠、酒精、洗衣粉、新洁尔灭、无菌水、剪刀、镊子、不锈钢盘、培养皿等。

2.试验设计

试验设计采取单因子试验，MS培养基为基本培养基，6-BA、NAA用量不变，消毒剂处理方法和时间不变，只变动消毒剂用量，分别为100㎎/L、80㎎/L、60㎎/L三个水平，用2%次氯酸钠作对照，试验目的，筛选不同用量必洁仕消毒剂对香石竹外植体杀菌效果以及对芽分化的影响。

3.操作方法与步骤

3.1房间消毒

按1片A剂加5mLB剂，熏蒸5立方米房间，如果房间污染较严重的，可使用3片A剂加15mLB剂，熏蒸5立方米房间。

3.2培养瓶浸泡消毒

取必洁仕消毒剂母液（1200㎎/L），按1：30比例将母液稀释，倒入一个塑料盆中，将培养瓶和瓶盖放入消毒药液中浸泡5分钟，用毛巾在消毒液中浸湿后，擦拭工作台面，除尘消毒，再用75%酒精喷雾台面，把培养瓶和瓶盖从消毒液中捞起，瓶口、瓶盖向下倒扣在工作台桌面上。剪刀、镊子等接种工具，经高压或干热灭菌后取出直接放入75%酒精瓶中备用。

3.3培养基及配制

MS+6-BA2-3㎎/L+NAA0.1-0.2㎎/L+琼脂7g/L+蔗糖28-30g/L

依次从配好的母液中量按需取出大量元素、微量元素、铁盐、有机物营养液和6-BA、NAA于烧杯中，称琼脂、蔗糖，加水熬溶化后，倒入营养液混合煮沸定溶，调整pH值为5.8-6.0，加入抗菌剂，煮沸2-3分钟，分装培养瓶，待凝固后备用。

3.4外植体表面清洗与消毒

3.4.1外植体选择

选择生长健壮无病虫害感染的当年生香石竹茎段，剪去叶片，再剪成带两个叶节的小段。

3.4.2表面清洗与消毒

表面清洗与消毒，外植体取回来后，用自来水清洗表面，入三角瓶中加水和少许洗衣粉，振荡洗涤1-2分钟，自来水冲洗后，再加少许新洁尔灭振荡洗涤后，在自来水下流水冲洗30-60分钟，倒掉水后，加入75%酒精摇动5-8秒，倒出酒精，用无菌水洗两次，再把外植体材料放在60㎎/L-100㎎/L浓度必洁仕牌二氧化氯消毒剂溶液中振荡消毒15分钟。

3.5接种与培养

3.5.1接种方法

用浸泡培养瓶的消毒液擦拭工作台，肥皂洗干净双手，再用75%酒精擦拭工作台和双手，打开瓶盖，从75%酒精瓶中取出剪刀和镊子，适当剪去外植体茎段的两端，用经过灭菌的无菌纸吸去水多余的液滴，把外植体插入培养基中，盖紧瓶盖。

3.5.2室内培养

有固定培养室的，把接种的培瓶摆放在培养架上，调控室内温度在25（±2）℃，光照2000-2500XL，也可利用自然光源在室内培养。

4.试验观察与统计

4.1污染统计

接种后3天起至12天结束观察，三个不同浓度的二氧化氯消毒剂对外植体消毒效果，分别为60∠100∠80，最好的是80㎎/L，最差的是60㎎/L。污染和外植体死亡症状主要有三种情况：一是在外植体及其转围培养基上生长出白色或灰白色毛和黑色块状物;二是在培养基上形成红色或白色菌斑，培养基变稀变臭;三是外植体叶或茎变白后死亡。其中浓度100污染较轻，变白致死的比例较重些，浓度为80、60的污染较重，变白致死较轻。对照试验的污染轻，但外植体变白死亡程度重。

4.2芽萌发与分化

外植体侧芽萌发与丛生芽分化，接种第7天开始至20天观察结束，二氧化氯消毒剂处理的外植体发芽早，接种7天开始萌芽，20天以后丛生芽数量显著增多，丛生芽密集，弱苗细苗无效苗多，有玻璃化苗出现。总体表现：侧芽萌发早（7天开始发芽）、多（平均1-12个），从生芽生长弱，叶片细长，叶色淡，有卷曲状。对照材料发芽迟，接种15天后才有侧芽萌发，丛生芽分化少，25天后丛生芽才分化，平均只有1-3个。

5.分析与讨论

5.1在外植体及其转围培养基上生长出白色或灰白色毛和黑色块状物，多为真菌或其他老霉菌引起的污染。可能原因，接种环境和空气带菌，消毒不干净;工作人员操作不熟练，不规范，敝开瓶口和材料暴露时间过久，被空气中杂菌感染所致。

5.2在培养基上形成红色或白色菌斑，培养基变稀变臭，多为细菌引起的污染。可能原因，工作台、接种工具用具用品消毒不干净，接种人员操作不规范，接种时工具与工作台，瓶外壁触碰，将菌源带入所致;还有可能是材料自身体内毒素向外溢出造成培养基污染。

5.3外植体变白后坏死，可能原因，消毒剂使用浓度过高，浸泡时间过长，外植体材料剪口破损，消毒液浸入材料内部造成细胞组织受药害导致中毒害死亡。

5.4外植体消毒不彻底，抗菌剂成分与配量没达到最佳，材料体内带毒，表面消毒不能彻底消除体内菌源，在培养过程中不断产生出霉菌体并漫延所致。

5.5讨论

必洁仕牌二氧化氯消毒剂，杀菌广谱、能够高效杀菌;无毒、无残留、对人身体没有伤害、对皮肤无刺激性;使用方法灵活多样，即可以熏蒸对空间消毒，又可以配制成稀释液，既可以对培养瓶浸泡杀菌，还可代替升汞作为外植体消毒，操作方便，省工省时，可大提高劳动效率。

但由于植物生长环境和材料本身差异，以及取材时间、部位不同，各种植物表面携带菌类和内生菌种类均不同，所以不同种类的外植体消毒方法、使用浓度、处理时间均有待进一步探索试验。

作者简介：

杨静（1981-）女 硕士研究生 园林工程师 研究方向 园林工程与植物组织培养技术