左氧氟沙星片微生物限度方法学研究

余晓谦 陈怡

摘要：为了建立左氧氟沙星片微生物限度检查方法，采用中和法加薄膜过滤法对左氧氟沙星片微生物限度方法学，

关键词：左氧氟沙星 微生物限度 中和法 薄膜过滤法

【中图分类号】R97  【文献标识码】A  【文章编号】1673-9026（2021）09-355-02

目前，随着左氧氟沙星片在市场上运用越来越广泛，但是未见左氧氟沙星片微生物限度方法的文献报道。根据中国药典 2020年版[2]微生物限度相关规定，进行了左氧氟沙星片微生物限度方法学验证。由于左氧氟沙星片为抗生素的一种，是喹诺酮类抗生素，因此选用硫酸镁中和剂，本品采用2020年版四部《中国药典》微生物限度计数法检查中的中和法+薄膜过滤法。

一、材料

1、仪器与用具：立式压力蒸汽灭菌器（LDZF-30、LDZM-60KCS-Ⅱ）、净化工作台（SW-CJ-1FD）、霉菌培养箱（MJ-250）、生化培养箱（SHP-150）、生化培养箱（SH-250）

2、稀释剂：硫酸镁、氯化钠、硫酸镁

3、培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：181119）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号190102：）、沙氏葡萄糖液体培养基（批号20180122：）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：20180302）、麦康凯琼脂培养基（批号：181211）、麦康凯液体培养基（批号：1082781）。

4、实验用菌种：铜绿假单胞菌（CMCC（B）10104）、枯草芽孢杆菌（CMCC（B）63501）、金黄色葡萄球菌（CMCC（B）26003）、白色念珠菌（CMCC（F）98001）、黑曲霉菌（CMCC（F）98003）、大肠埃希菌（CMCC（B）44102）。

二、方法

1、菌液制备：

①取经35℃培养18～24小时的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的新鲜胰酪大豆胨液体培养物1ml，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%氯化钠溶液制成菌数不大于100cfu的菌悬液;做活菌计数备用。

②取经20℃～25℃培养2～3天的白色念珠菌液体培养物1ml，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%氯化钠溶液制成菌数不大于100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。

③接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面中，经20℃～25℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%氯化钠溶液，洗下霉菌孢子，用带有棉花的球形吸管取出菌液至无菌试管内，将孢子懸液稀释制成含孢子数不大于100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。

2、供试品制备

取本品10g，用0.1mol/L硫酸镁的0.9%氯化钠溶液加至100ml，充分震荡，摇匀，制成1：10供试液。静置片刻，取1：10上清液适量，用0.1mol/L硫酸镁的0.9%氯化钠溶液稀释制成1：20和1：100的供试液

三、验证方法

3.1计数方法适用性验证

3.1.1试验组：分别取1：100的供试品溶液各1ml，加至500ml稀释剂中混匀，采用薄膜过滤法，以0.1mol/L硫酸镁的0.9%氯化钠溶液冲洗5次，每次冲洗量为100 ml，在最后一次冲洗液中加入试验菌。试验菌共5组，分别是金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液，过滤后取出滤膜，菌面朝上，分别贴于胰酪大豆胨琼脂平皿中于30～35℃培养，各制备两个平行皿，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3组培养3天，白色念珠菌、黑曲霉菌2组培养5天，逐日观察结果，计数。

3.1.2菌液组：分别取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液，测定每一菌株的加入试验菌数。

3.1.3供试品对照组：取制备好的供试液，用稀释液代替菌液同试验组操作，每种培养基平行制备2个平皿。

3.1.4阴性对照组：用不含中和剂的相应稀释液替代供试液，进行阴性对照组试验，每种培养基平行制备2个平皿。

3.1.5中和剂对照组：用含中和剂的稀释液分别测定金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液每一菌株的加入试验菌数。

3.2霉菌和酵母菌总数检查方法验证

3.2.1试验组：取1：20、1：50、1：100的供试品溶液各1ml加至500ml的稀释液中，摇匀，薄膜过滤，每张膜用稀释液500ml分次冲洗，在最后一次冲洗液中加入1ml试验菌， 试验菌共2组，分别是白色念珠菌、黑曲霉菌，过滤后取出滤膜，菌面朝上，将滤膜贴于相应的沙氏葡萄糖琼脂平皿，于20～25℃培养，分别各制备2个平皿，培养5天，逐日观察结果，计数。

3.2.2菌液组：分别取白色念珠菌、黑曲霉菌液，测定每一菌株的加入试验菌数。

3.2.3供试品对照组：取制备好的的供试品溶液，以稀释液代替菌液同试验组操作，每种培养基平行制备2个平皿。

3.2.4阴性对照组：用不含中和剂的相应稀释液替代供试液，进行阴性对照组试验，每种培养基平行制备2个平皿。

3.2.5中和剂对照组：以含中和剂的稀释液分别测定白色念珠菌、黑曲霉菌液每一菌株的加入试验菌数。

3.3控制菌大肠埃希菌检查适用性验证

3.3.1方案①

3.3.1.1试验组：取1：10的供试品溶液适量稀释成1：20和1：40的供试品溶液，取1：20的供试品溶液20ml和1：40的供试品溶液40ml分别加入500ml的0.1mol/L硫酸镁的0.9%氯化钠溶液中，摇匀，薄膜过滤，以0.1mol/L硫酸镁的0.9%氯化钠溶液冲洗10次，每次冲洗量为100 ml，在最后一次冲洗液中加入1ml不大于100cfu/ml大肠埃希菌，滤干后取滤膜分别加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中;

3.3.1.2中和剂对照组：同试验组操作，不加任何溶液以0.1mol/L硫酸镁的%0.9氯化钠溶液冲洗滤膜10次，每次冲洗量为100 ml，滤干后取滤膜加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中;

3.3.1.3阳性对照组：取1ml不大于100cfu/ml大肠埃希菌，不加任何供试液，同试验组操作。

3.3.1.4供试品组：取1：20和1：40的供试品溶液20ml和40ml分别加入500ml的0.1mol/L硫酸镁的0.9%氯化钠溶液中，摇匀，薄膜过滤，以0.1mol/L硫酸镁的0.9%氯化钠溶液冲洗10次，每次冲洗量为100 ml，滤干后取滤膜分别加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中。

3.3.2方案②

3.3.2.1试验组：取1：10的供试品溶液适量稀释成1：40，再取1：40的供试品溶液40ml加入500ml的0.1mol/L硫酸镁的0.9%氯化钠溶液中，摇匀，薄膜过滤，以0.1mol/L硫酸镁的0.9%氯化钠溶液冲洗10次，每次冲洗量为100 ml，在最后一次冲洗液中加入1ml不大于100cfu/ml大肠埃希菌，滤干后取滤膜和40ml0.1mol/L硫酸镁的0.9%氯化钠溶液加入400ml胰酪大豆胨液体培养基中;

3.3.2.2中和剂对照组：取0.1mol/L硫酸镁的0.9%氯化钠溶液40ml薄膜过滤，同试验组操作，以0.1mol/L硫酸镁的%0.9氯化钠溶液冲洗10次，每次冲洗量为100 ml，滤干后取滤膜和0.1mol/L硫酸镁的0.9%氯化钠溶液40ml加入400ml胰酪大豆胨液体培养基中;

3.3.2.3阳性对照组：取1ml不大于100cfu/ml大肠埃希菌，不加任何供试液，同试验组操作。

3.3.2.4供试品组：取1：40的供試品溶液40ml加至500ml的0.1mol/L硫酸镁的0.9%氯化钠溶液中，摇匀，薄膜过滤，以0.1mol/L硫酸镁的0.9%氯化钠溶液冲洗10次，每次冲洗量为100 ml，滤干后取滤膜和0.1mol/L硫酸镁的0.9%氯化钠溶液40ml加入400ml胰酪大豆胨液体培养基中;

置于温度30℃～35℃培养18～24小时后，观察结果，结果见附件三表2和表3。取1ml培养物接种至100ml麦康凯液体培养基，于温度42℃～44℃培养24～48小时，观察结果。

3.4.4.2取上述麦康凯液体培养基中培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基上，于30℃～35℃培养18～72小时，观察结果。

四结果

4.1计数方法适用性验证

采用中和法+薄膜过滤法，冲洗量为500ml，试验组菌落数均值减去供试品对照组菌落数均值与菌液对照组菌落数均值的比值应在0.5～2范围内;中和剂对照组菌落数均值与菌液对照组菌落数均值的比值应在0.5～2范围内。该方法适用于左氧氟沙星片需氧菌检查。

采用中和法+薄膜过滤法，冲洗量为500ml，试验组菌落数均值减去供试品对照组菌落数均值与菌液对照组菌落数均值的比值应在0.5～2范围内;中和剂对照组菌落数均值与菌液对照组菌落数均值的比值应在0.5～2范围内。若各试验菌的回收比值均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证。

采用中和法+薄膜过滤法，冲洗量为1000ml，试验组：结果为阳性检出大肠埃希菌;阳性组：结果为阳性检出大肠埃希菌，中和剂对照组：结果为阴性未检出大肠埃希菌;供试品组：结果为阴性未检出大肠埃希菌。若试验组检出试验菌，则照所用的供试液制备方法及控制菌检查方法进行供试品控制菌检查方法的验证。

左氧氟沙星片微生物限度检查方法适用性试验验证过程中，各项目都合格。左氧氟沙星片微生物限度检查方法适用性试验验证方法进行。左氧氟沙星片微生物限度检查方法适用性试验证过程中，各项目测试进行顺利，结果均符合预期。

参考文献：

[1]唐映红，伍参荣，魏云，吉兰.盐酸左氧氟沙星体内外抗菌作用研究[J].医药导报，2007，26（9）：983-986.