基于生物信息学探讨芍药甘草汤作用机制

刘嫣然 施春英 李玲

摘要：基于生物信息学方法，探究了芍药甘草汤治疗疾病关键基因和通路。采用中药网络数据库平台（TCMSP）、GeneCards数据库搜索芍药甘草汤的靶点和TN（三叉神经痛）对应的所有靶点;利用细胞图谱3.7.2软件构建了“药物—成分—疾病—靶点”网络图并对关键靶点进行GO和KEGG分析。研究结果表明，TCMSP数据库共检索得到芍药甘草汤活性成分106个，IL1B、VEGFA、MAPK8等是芍药甘草汤治疗三叉神经痛的核心靶点，揭示了芍药甘草汤治疗三叉神经痛的作用机制。

关键词：生物信息学;网络药理学;芍药甘草汤;潜在机制

中图分类号：R285.5 文献标志码：A

文章编号：1006-1037（2021）03-0063-08

芍药甘草汤是由白芍、甘草组成，具有柔肝、缓急止痛的功效，其中白芍具有养血调经、柔肝止痛、平抑肝阳的功效，甘草具有健脾益气、清热解毒、化痰止咳、止痛的功效[1]。现代临床研究表明，芍药甘草汤具有显著的解痉、抗炎、镇痛、止咳、平喘、抗过敏、抗病毒、保肝利胆的功效，在临床中常应用治疗多种疼痛性疾病、痉挛性疾病、炎症性疾病、帕金森病及支气管哮喘[2]。张传江[3]运用芍药甘草汤治疗90例三叉神经痛患者疼痛及睡眠质量的影响，有效改善三叉神经痛患者疼痛情况，提高睡眠质量。随着中医药的不断深入研究和发展[4]，芍药甘草汤在临床中用于治疗三叉神经痛的疗效和应用价值逐渐被认可[5]。生物信息学是一门利用生物学、信息学、计算机科学等技术将生物信息进行采集、处理、存储、传播，分析和解释生物信息以探索生命的学科[6]。网络药理学是综合基因组学、蛋白质组学和系统生物学的一门新兴的学科[7]。网络药理学为搜索和检索传统中药提供了一整套系统的方法，在搜集活性成分、预测中药靶点及机制、创新药物等方面产生重要影响[8]。利用生物信息学和网络药理学技术对中药的复方和单体进行研究成为了近年来研究热点和国自然基金重点扶持领域。本文运用网络药理学和生物信息学的方法分析出了药物的活性成分并预测其关键靶点[9]，揭示了芍药甘草汤治疗三叉神经痛的关键通路及潜在作用机制，为后续的实验验证提供参考。

1 方法

1.1 芍药甘草汤活性成分检索

通过TCMSP数据库检索芍药甘草汤的活性成分，在TCMSP数据库设定口服利用度（OB）≥30、类药性（DL）≥0.18为筛选标准;在Swiss Target Prediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）预测芍药甘草汤的潜在靶点;将上述得到的芍药甘草汤的靶点导入至Uniprot（https：//www.unitprot.org/）数据库对基因进行标准化处理。

1.2 TN疾病相关靶点获取

以“trigeminal neuralgia”為关键词在OMIM（http：//www.omim.org/）和GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库进行检索，得到与TN有关的疾病靶点。

1.3 芍药甘草汤治疗TN的潜在靶点

运用Venn（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在线平台获取芍药甘草汤与TN靶点的交集部分，得到芍药甘草汤治疗TN的潜在作用靶点。

1.4 药物—成分—疾病—靶点网络图

将芍药甘草汤的活性成分及靶点、以及“药物—疾病”交集靶点导入Cytoscape3.7.2软件，构建“药物—成分—疾病—靶点”网络图，其中节点代表药物、活性成分、靶点、疾病，边代表芍药甘草汤活性成分与疾病、疾病与靶点之间的相互作用关系。

1.5 PPI网络图构建及核心靶点网络图构建

将上述得到的“药物—疾病”交集靶点导至STRING（http：//string-db.org）数据库，并将物种限定为人（Homo sapiens），运用String数据库预测蛋白与蛋白之间的相互作用关系。将STRING数据库得到的数据以tsv格式导入至Cytoscape3.7.2软件中，根据节点度值（Degree）大于平均值作为筛选条件，得到芍药甘草汤治疗TN的核心靶点。

1.6 GO生物过程和KEGG通路富集分析

运用David（https：//david.ncifcrf.gov/）在线平台对“药物—疾病”的交集靶点进行GO生物过程和KEGG通路的富集分析。并以P<0.05为筛选标准，然后将筛选得到的生物过程导入至OmicShare平台，进行数据的可视化处理。

2 结果

2.1 芍药甘草汤活性成分收集

通过TCMSP在线平台检索得到芍药甘草汤的所有活性成分，以OB≥30%、DL≥0.18为筛选标准，筛选得到芍药甘草汤活性成分106个，其中白芍13个，甘草93个，具体见表1，删除重复值后得到芍药甘草汤靶点共计130个。

2.2 芍药甘草汤与TN交集靶点Venn图

通过OMIM和GeneCards数据库检索TN的靶点删除重复值后共249个，将得到的药物靶点映射到疾病靶点中，获得25个交集靶点，制成Venn图，如图1，说明芍药甘草汤可能通过以上靶点参与治疗TN。

2.3 药物—成分—疾病—靶点网络图构建

将上述得到的药物活性成分及靶点、“药物—疾病”的交集靶点导入至Cytoscape3.7.2软件中，构建“药物—成分—疾病—靶点”网络图。图2中共有243个节点，其中“菱形”代表白芍的活性成分，“圆形”代表甘草的活性成分，“V形”代表靶点。

2.4 PPI网络图构建及核心靶点筛选

将Venn图获得的交集靶点导入至STRING数据库，将物种限定为“人”（homo sapiens），得到25个节点，129条边，平均节点数为10.3，制成PP2网络图，见图3;将STRING数据以TSV格式导入Cytoscape3.7.2软件中，以Degree值大于11作为筛选标准条件得药物治疗疾病的核心靶点网络图，见图4，主要包括IL1B、VEGFA、MAPK8、MAPK1、PTGS2、JUN、CCL2等，提示芍药甘草汤中的主要活性成分芍药苷、谷甾醇、β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素、苯甲酰芍药苷、甘草黄酮可能通过以上靶点参与治疗三叉神经痛。

2.5 GO富集结果分析

对芍药甘草汤治疗TN的潜在靶点进行GO生物功能分析，以P<0.05和FDR<0.05为筛选标准，得到GO生物条目148条，其中生物过程109条，分子功能23条，细胞组分16条，其中BP主要涉及一氧化氮生物过程的正调控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、对药物的反应（response to drug）、ERK1和ERK2级联的正向调节（positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade）等，CC主要涉及神经元投射（neuron projection）、细胞外空间（extracellular space）等，MF主要包括酶结合（enzyme binding）、单胺跨膜转运蛋白活性（monoamine transmembrane transporter activity）、蛋白质同二聚活性（protein homodimerization activity）等。说明芍药甘草汤的活性成分可能通过以上生物过程参与治疗TN。按P值降序排列，制成气泡图展示，见图5、6、7。

2.6 KEGG通路富集分析

采用2.5节同样的方法富集分析得到44条KEGG通路（P<0.05，FDR<0.05），靶基因主要富集在癌症信号通路、TNF信号通路、VEGF信号通路、HIF-1信号通路、雌激素信号通路、NOD样受体信号通路以及ErbB信号通路等信号通路中，说明芍药甘草汤的潜在靶点可能通过调控以上通路参与治疗TN。按P值降序排列，将筛选出的前20条信号通路制成表格展示见表2。

3 讨论

三叉神经痛被归属于“头风”、“偏头痛”范畴[10]，病因多由于外感风寒或风热，肝郁气滞阻滞经络，不通则痛[11]，芍药甘草汤具有滋阴柔肝、缓慢急迫止痛的功效，在临床中常用于治疗各种缓急疼痛[12]。李伯英[11]利用芍药甘草汤加减治疗三叉神经痛患者，其临床总有效率97.1%，说明芍药甘草汤加减能够有效减轻三叉神经痛患者的临床症状，且疾病肺的复发率低，值得推广和应用。但由于中药复方具有多成分、多靶点的特点，作用机制较为复杂，因此本文运用生物信息学方法探讨芍药甘草汤治疗TN的作用机制，以期为实验验证提供理论依据。

本文通过检索TCMSP得到芍药甘草汤活性成分106个，包括芍药苷、谷甾醇、β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素、苯甲酰芍药苷、甘草黄酮等。洪嘉琪等[13]通过实验研究发现芍药苷可以通过抑制炎症因子的释放和抑制Akt-NF-κB信号的激活减轻疼痛，且具有助眠作用[14]，因此芍藥苷可以有效减轻三叉神经痛患者的疼痛及疼痛带来的失眠症状。神经性疼痛多与炎症反应有关，槲皮素可以通过调控Wnt/β-catenin信号通路，影响脊髓中炎症因子的水平发挥镇痛作用[15]，因此槲皮素可以抑制相关炎症因子的激活治疗三叉神经痛。芍药中的芍药总苷和甘草中的甘草黄酮协同作用可以下调Sirt1蛋白的表达[16]，减轻神经疼痛。说明芍药甘草汤中的多个活性成分可以协同参与治疗三叉神经痛。

通过图4分析发现，芍药甘草汤中的活性成分主要通过IL1B、VEGFA、MAPK8、MAPK1、PTGS2、JUN、CCL2等核心靶点治疗三叉神经痛。IL1B是一种可以调节肌肉疼痛的炎性因子，可以诱导前列腺素的产生而发生疼痛反应，因此抑制ILIB炎症因子可以拮抗疼痛症状[17]。VEGFA是血管内皮生长因子，其参与血管新生[18]，可以与VEGFA-2受体结合激活TRPV1和TRPA1通路，保护感觉神经元的疼痛信号传递[19]。前列腺素内过氧化物合成酶2（PTGS2）可以参与调节疼痛生理病理过程，IRE1αlpha-XBP1可以通过调节PTGS2的表达参与调节疼痛反应[20]。研究发现趋化因子2（CCL2）参与慢性疼痛，巨噬细胞病理性神经疼痛的发生发展发挥重要作用，CCL2可能引起致痛因子的释放，作用于感觉神经元。因此，提前去除巨噬细胞可以缓解由CCL2引起的热痛觉过敏和机械痛觉过敏[21]。以上研究证实芍药甘草汤中的多个活性成分可以通过多靶点参与治疗三叉神经痛。

通过富集分析发现芍药甘草汤主要通过一氧化氮生物过程的正调控、对药物的反应、ERK1和ERK2级联的正向调节、神经元投射、细胞外空间、酶结合、单胺跨膜转运蛋白活性、蛋白质同二聚活性等GO生物过程协同参与治疗三叉神经痛。KEGG通路富集发现靶基因主要富集于癌症信号通路、TNF信号通路、VEGF信号通路、HIF-1信号通路、雌激素信号通路、NOD样受体信号通路、E rbB信号通路等信号通路中。TNF信号通路中炎症因子主要是TNF-α，研究表明TNF-α是参与疼痛的重要炎症介质，白芍能在一定程度上抑制TNF-α的表达[22]，因此芍药甘草汤能在一定程度减轻三叉神经痛。ErbB信号通路在分子水平上参与疼痛的形成和发展，因此阻断ErbB信号通路可以干扰疼痛的产生[23]。疼痛的产生与炎症反应密切相关，研究表明HIF-1信号通路、NOD样受体信号通路等信号通路参与炎症反应[24]，因此抑制上述信号通路相关因子的表达可以在一定程度减轻三叉神经痛的症状。进一步证实芍药甘草汤可以通过多成分、多靶点、多通路参与治疗三叉神经痛。

4 结论

研究通过生物信息学的网络药理学方法系统对芍药甘草汤治疗三叉神经痛的作用机制进行了分析。芍药甘草汤中的成分复杂，主要通过多成分、多靶点、多通路参与治疗TN，为后续用药和后续实验验证提供理论基础和理论依据。

参考文献

[1]曲缘章， 马生军， 朱广伟， 等. 芍药甘草汤的历史沿革与现代研究[J]. 中国实验方剂学杂志， 2020， 26（6）： 216-225.

[2]张保国， 刘庆芳. 芍药甘草汤方剂学实验研究[J]. 中成药， 2012， 34（7）： 1354-1358.

[3]张传江. 芍药甘草汤加减治疗对三叉神经痛患者疼痛及睡眠质量的影响[J]. 国际医药卫生导报， 2018， 24（18）： 2809-2812.

[4]宗彦霞. 熄风通络止痛汤联合针灸治疗三叉神经痛疗效观察[J/OL].实用中医内科杂志，（2020-04-14）[2020-11-14]. https：//doi.org/10.13729/j.issn.1671-7813.Z20190630.

[5]胡博路， 孟洁， 胡迎芬， 等. 30种中草药清除自由基的研究[J]. 青岛大学学报（自然科学版）， 2000，13（2）： 38-40.

[6]臧凝子， 李品， 庞立健， 等. 基于网络药理学和生物信息学小青龙汤治疗支气管哮喘的关键基因和通路筛选[J/OL]. 中国实验方剂学杂志（2020-10-22）[2020-11-03].https：//doi.org/10.13422/j.cnki.syfjx.20202313.

[7]DUAN S， NIU L， YIN T， et al. A novel strategy for screening bioavailable quality markers of traditional Chinese medicine by integrating intestinal absorption and network pharmacology： Application to Wu Ji Bai Feng Pill[J]. Phytomedicine， 2020， 76：153226.

[8]LI S， ZHANG B. Traditional Chinese medicine network pharmacology： Theory， methodology and application[J]. Chinese Journal of Natural Medicines， 2013， 11（2）： 110-120.

[9]冯鹤翔， 涂轶. 木质素生物合成的研究[J]. 青岛大学学报（自然科学版）， 2018， 31（1）： 46-54.

[10] 曾强， 吴珍霞， 张勇， 等. 活血逐瘀解挛汤结合扳机点注射A型肉毒杆菌毒素对三叉神经痛患者TNF-α、IL-6水平的影响[J]. 广州中医药大学学报， 2020， 37（8）： 1421-1425.

[11] 李伯英. 芍药甘草汤加减联合针刺疗法治疗原发性三叉神经痛的效果观察[J]. 承德医学院学报， 2018， 35（2）： 129-131.

[12] 宁云红， 郭承伟. 以21篇临床文献综述芍药甘草汤应用概况[J]. 中医药导报， 2017， 23（3）： 83-84+88.

[13] 洪嘉琪， 史家欣， 敖欢， 等. 芍药苷通过抑制脊髓Akt-NF-kB信号通路及小胶质细胞激活缓解炎症性疼痛[J]. 中国生物化学与分子生物学报， 2018， 34（3）： 325-333.

[14] 孟胜喜， 霍清萍. 芍药苷对神经系统的作用及其机制的研究[J]. 西部中医药， 2020， 33（4）： 150-153.

[15] 严进红， 韩克跃， 夏杰，等. 槲皮素减轻紫杉醇致神经病理性大鼠疼痛的作用与机制[J]. 天然产物研究与开发， 2019， 31（12）： 2065-2070+2181.

[16] ZHOU D L， ZHANG S Q， HU L， et al. Inhibition of apoptosis signal-regulating kinase by paeoniflorin attenuates neuroinflammation and ameliorates neuropathic pain[J]. Journal of Neuroinflammation， 2019， 16（1）：doi： 10.1186/s12974-019-1476-6.

[17] MANJAVACHI M N， MOTTA E M， MAROTTA D M， et al. Mechanisms involved in IL-6-induced muscular mechanical hyperalgesia in mice[J]. Pain， 2010， 151（2）： 345-355.

[18] HULSE R P. Role of VEGF-A in chronic pain[J]. Oncotarget， 2017， 8（7）：10775-10776.

[19] 褚雪鐳， 侯成志， 毛昀，等. 芍药甘草汤治疗癌性疼痛作用机制的网络药理学研究[J]. 海南医学院学报， 2019， 25（22）： 1686-1692.

[20] SARAH M R， GONZALEZAD B， MATTHEW M C， et al. SNPs in PTGS2 and LTA predict pain and quality of life in long term lung cancer survivors[J]. Lung Cancer， 2012， 77（1）：217-223.

[21] 沈怡佳， 陈辉， 熊源长. 趋化因子在慢性疼痛中的作用研究进展[J]. 中国疼痛医学杂志， 2017， 23（11）： 846-850.

[22] LI Q S， ZHANG X. Epigallocatechin-3-gallate attenuates bone cancer pain involving decreasing spinal Tumor Necrosis Factor-α expression in a mouse model[J]. International Immunopharmacology， 2015， 29（2）：818-823.

[23] 熊琼， 王龙， 王晞. NRG-ErbB信号在神经病理性疼痛中的研究进展[J]. 医学综述， 2017， 23（5）： 877-881+886.

[24] 朱培， 唐梦燕， 闫东梅. HIF-1α及其相关信号转导通路在疾病中的研究进展[J]. 中国免疫学杂志， 2020， 36（13）： 1650-1653+1657.