程成,李斌,王雅丽,赵楠,苏莹,聂虎帅,华金平
(中国农业大学农学院棉花遗传育种与基因组研究实验室/作物遗传改良北京市重点实验室/杂种优势利用教育部重点实验室,北京 100193)
陆地棉(Gossypium hirsutumL.)是重要的经济作物[1]。棉花新品种选育过程中,产量潜力与纤维品质呈负相关,同步改良难度大[1-2]。 棉花纤维是一种高度伸长的细胞,由胚珠表皮细胞发育而来[3]。 棉纤维的发育包括4 个不同但又相互重叠的时期:起始期、伸长期、次生壁细胞积累期和成熟期。 纤维的起始和伸长对纤维的数量、长度和细度有很大的影响,是决定皮棉产量和品质的主要阶段[4]。
植物激素在棉花纤维发育过程中起重要作用。 生长素具有多方面生理效应,是胚珠体外培养所必需的植物激素[5]。 外源施用吲哚-3- 乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)可以促进纤维的起始[6],增加胚珠表皮纤维数量[7]。研究发现,来源于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)以及假单孢菌(Pseudomonas savastanai)的iaaM基因[8],编 码色氨酸单加氧酶 (Tryptophan mono-oxygenase),参与由色氨酸产生IAA 的生物合成途径[9]。iaaM基因在E6 启动子的驱动下在陆地棉DP50 中高效表达,可显著增加内源IAA 含量,但对纤维品质无明显影响[10]。 将由矮牵牛种子表皮特异启动子FBP7 启动的植物生长素受体iaaM基因转入棉花品种冀棉14 中育成的转基因棉新种质IF1-1, 棉花胚珠纤维起始期表皮细胞IAA 水平提高,种子短绒减少,皮棉产量和纤维细度显著提高[1]。
关于棉花种质IF1-1 育种应用已有一系列报道。 以IF1-1 为父本,将iaaM基因转育到9 个综合性状优良的棉花品种中,证明该基因能显著改良棉花F1和F2的衣分和马克隆值,并且对籽指、铃重、单株结铃数等产量性状和纤维长度、强度等品质性状无负效应[11]。 以IF1-1 为父本,通过回交育种将iaaM基因导入低衣分、 高马克隆值的短季棉晋棉11,回交后代衣分提高,马克隆值降低,早熟性好[12]。 以IF1-1 为父本配制6 个杂交组合, 发现iaaM基因可显著提高纤维上半部平均长度、长度整齐度指数和断裂比强度,降低籽指,且6 个组合的籽指与衣分、纤维上半部平均长度均呈负相关[13]。 以IF1-1 为供体将iaaM基因转育到86 个衣分和纤维细度有待改良的棉花品系(种)中,可显著改良马克隆值,且对其他性状无不利影响[14]。 以IF1-1 为父本与鄂赣棉29 等13份母本材料杂交,以赣棉杂1 号为对照,发现大多数杂交组合的铃重、籽指等表现为正向竞争优势,部分组合纤维品质有显著竞争优势[15]。 以IF1-1 与鄂抗棉10 号选、TM-1、冀棉14、优质-1等材料分别进行正反交, 分析F1主要农艺性状,发现:多数组合铃重增加,衣分提高,马克隆值改良[16]。通过杂交将父本IF1-1 中的iaaM基因转入母本N027、N028、N106、N030,结果发现iaaM基因与衣分弱正相关, 与纤维上半部平均长度、长度整齐度指数、断裂比强度显著正相关,与马克隆值显著负相关,与断裂伸长率负相关[17]。 上述研究未对杂交后代进行分子检测, 影响结果的可靠性。
本研究以IF1-1 为父本, 与不同遗传背景的棉花品种组配,结合分子检测确定杂交种,通过对杂种F1的衣分、 籽指和纤维品质性状分析,研究IF1-1 在棉花产量和纤维品质改良中的作用,分析FBP7::iaaM基因是否对种子发芽率和发芽势产生负面效应。
转FBP7::iaaM基因的陆地棉种质系IF1-1[1],由西南大学裴炎教授、侯磊教授研究团队提供。
母本材料包括中棉所12 及其系谱涉及的材料共7 份[18](包括中棉所12 及亲本乌干达4 号、邢台6871;亲本系谱涉及的早代亲本品种:鲁棉研16、豫棉11、晋棉33、晋棉20,均由中国农业科学院棉花研究所叶武威研究员团队提供);鄂抗棉9 号及其骨干亲本共16 份材料[19](包括中棉所2 号、陕棉7 号、陕棉3 号、鄂抗棉9 号、岱字棉15、徐州1818、鄂荆1 号、锦育3 号、中7263、MO-3、锦棉2 号、荆棉4 号、安通SP21、隆字棉、锦3-34-3、川57-681,由中国农业科学院棉花研究所杨代刚研究员、马雄风研究员团队提供)。
2018 年冬在海南三亚种植IF1-1 材料,分单株提取植株叶片DNA,提取方法是改良的CTAB法[20]。 通过聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测阳性植株,使用的引物见表1。使用2 对引物组合(IF_up/IF_dn1,IF_up/IF_dn2)扩增结果均为阳性,则认为植株携带iaaM基因。
表1 IF1-1 的阳性植株分子鉴定引物序列Table 1 The primers used in FBP7::iaaM gene detection
以阳性IF1-1 为父本,2018 年冬在海南与23份不同遗传背景的棉花品种杂交。F1与亲本材料于2019 年夏季在河北省河间市国欣总会试验基地种植2 行区(行长5 m)。 取部分植株样品进行检测。F1阳性植株鉴定使用的引物和基因检测方法同1.2。
F1阳性植株和23 份棉花品种各收20 个铃,用于考种。 考种指标为小样衣分和籽指。 轧花考种后,取15 g 纤维样品寄送中国彩棉(集团)股份有限公司测试中心(乌鲁木齐)使用USTERRHVI 棉纤维测试系统完成纤维品质检测。 纤维品质测定指标包括纤维上半部平均长度、长度整齐度指数、断裂比强度、断裂伸长率和马克隆值。
F1与母本棉籽脱绒, 用于种子发芽试验,试验采用滤纸卷直立法[21]。选取50 粒发育正常的种子用蒸馏水浸种8 h,种子露白后,珠孔朝下均匀地摆放在滤纸上,用滤纸卷好,垂直放入大烧杯中,加入适量蒸馏水使滤纸保持湿润,置于28 ℃恒温培养箱中暗培养。 3 d 后统计种子发芽势(Germination potential,GP),7 d 后统计种子发芽率(Germination rate,GR)。 试验设3 次重复。
使用IBM SPSS Statistics 21.0 完成性状数据的方差分析和相关性分析。 相关性的显著性分析采用双侧检验。
IF1-1 材料分单株提取叶片DNA, 使用表1的引物进行PCR 检测。 结果在检测的23 个单株中,18 株为转基因阳性株 (图1), 阳性株率为78.26%。
F1种子于2019 年在河北省河间市种植,每个材料取10 株 (单行不足10 株的取全部单株)挂牌、取样、提取DNA,共鉴定222 株。23 个组合F1经PCR 检测得到69 株阳性株, 阳性株率为31.08%。其中,邢台6871、陕棉7 号、鄂抗棉9 号、鄂荆1 号、 川57-681 的F1仅检测到1 株阳性株(表2)。
表2 IF1-1 配组杂交F1 材料植株阳性检测Table 2 Detection of positive individuals of F1 with FBP7::iaaM gene
IF1-1 携带的FBP7::iaaM基因转入不同品系后,大部分F1衣分显著提高。本研究检测了23 份F1材料的衣分, 其中21 个杂交组合F1较对照母本提高1.73~11.82 百分点(表3),平均提高6.60百分点。 其中,鲁棉研16 的F1衣分增幅最大。 例外的是, 晋棉20、 鄂抗棉9 号的衣分分别为44.91%、42.69%, 相应的F1衣分分别降低为43.87%、42.25%(仍为高衣分材料)。
表3 杂种F1 与母本的衣分比较Table 3 Difference analysis on lint percentage of F1 hybrids and female parents %
中棉所12 及其系谱材料:中棉所12 衣分为41.58%,中棉所12 的F1提高了2.81 百分点。 衣分高于中棉所12 的系谱材料, 其F1衣分增幅均低于中棉所12 的F1; 衣分低于中棉所12 的,其F1衣分增幅反而高于中棉所12 的F1。
鄂抗棉9 号及其骨干亲本:鄂抗棉9 号衣分为42.69%, 其F1衣分为42.25%(降低了0.44 百分点);鄂荆1 号衣分为44.30%,其F1衣分提高7.37 百分点,为51.67%。 一些衣分低的材料其F1衣分显著提高。
相对于各母本,22 个F1的籽指降低0.2~5.3 g,平均降低1.8 g;岱字棉15/IF1-1 的F1籽指降幅最大;仅晋棉20/IF1-1 的F1籽指比母本提高0.9 g(表4)。
中棉所12 籽指11.6 g, 对应的F1籽指降低了0.8 g。 亲本乌干达4 号和邢台6871 的籽指分别为14.6 g、11.6 g, 相应的F1籽指分别为11.2 g、9.6 g,其F1籽指降幅均高于中棉所12 的F1。
鄂抗棉9 号籽指为10.7 g,相应F1的籽指为9.9 g,降低0.8 g;骨干亲本中7263、陕棉7 号、锦棉2 号、鄂荆1 号籽指分别为14.2 g、13.7 g、13.0 g、12.7 g, 相应的F1籽指分别为13.2 g、10.4 g、10.6 g、9.5 g, 较各自母本分别降低1.0 g、3.3 g、2.4 g、3.2 g(表4)。
20 份F1材料种子发芽试验结果表明, 有10份材料F1的发芽势高于或等于其母本发芽势。方差分析发现,F1的发芽率和发芽势与相应母本的发芽率和发芽势差异均不显著(表4)。
表4 F1 与母本籽指、发芽势与发芽率比较分析Table 4 Difference between F1 and female parent in seed index, seed germination potential and seed germination rate
IF1-1 对纤维品质性状尤其是马克隆值的影响值得关注。 其中,鄂荆1 号的F1的纤维品质数据缺失。 其余22 份F1的纤维品质检测结果(表5)表明,马克隆值处于A 档的F1材料相应母本为邢台6871、中棉所12、鲁棉研16、豫棉11、晋棉20、鄂抗棉9 号、MO-3、锦棉2 号、荆棉4 号这9 份;处于C 档的材料母本为陕棉7 号、岱字棉15、安通SP21、锦3-34-3、川57-681;其余8 份材料均为B 档。 相应地,22 份母本材料马克隆值处于A 档的有:陕棉7 号、鄂抗棉9 号、锦育3 号、安通SP21、锦3-34-3、川57-681;处于C 档的材料有:豫棉11、陕棉3 号、岱字棉15、中7263、隆字棉;其余11 份材料均为B 档。 因此,11 份材料马克隆值等级得到提升。 中棉所12 及其系谱材料的F1马克隆值等级提升的有:邢台6871、中棉所12、鲁棉研16、豫棉11、晋棉20;鄂抗棉9 号及其骨干亲本的F1马克隆值等级提升的有:陕棉3 号、中7263、MO-3、锦棉2 号、荆棉4 号、隆字棉。 5 份材料F1的马克隆值等级下降,其余6 份材料F1的马克隆值等级不变(表5)。
22 份母本材料的纤维上半部平均长度范围为26.05~31.82 mm,平均为29.07 mm,其中陕棉7 号最长,锦棉2 号最短;相应的F1纤维上半部平均长度范围为27.40~32.25 mm, 平均为30.40 mm,其中鲁棉研16 的F1最长,安通SP21的F1最短。 与母本相比,有17 个F1纤维上半部平均长度增加,平均增加2.0 mm。中棉所12 纤维上半部平均长度为29.44 mm, 对应的F1增加2.50 mm,是中棉所12 系谱材料中增幅最高的。鄂抗棉9 号纤维上半部平均长度为29.16 mm,对应的F1增加了1.87 mm;纤维上半部平均长度大于鄂抗棉9 号的骨干亲本,其F1纤维上半部平均长度增幅均小于鄂抗棉9 号F1的增幅(表5)。
表5 F1 与母本材料纤维品质性状表现Table 5 The comparison on fiber quality traits between F1 and its female parents
22 份母本材料的长度整齐度指数为82.10%~87.65%,平均为84.57%,其中中棉所12 长度整齐度指数最高,锦育3 号的最低。22 个F1的长度整齐度指数为80.80%~88.75%,平均为85.21%,中7263 的F1最高, 陕棉3 号的F1最低;13 份材料F1的长度整齐度指数较母本提高, 平均提高1.93 百分点(表5)。
22 份母本材料的断裂比强度为24.52~35.38 cN·tex-1,平均为28.74 cN·tex-1,其中陕棉7 号最高,陕棉3 号最低。 22 个F1的断裂比强度为27.13~33.21 cN·tex-1, 平均为30.24 cN·tex-1,其中中7263 相应的F1最高, 豫棉11 相应的F1最低。 14 份材料的断裂比强度提高(平均提高3.79 cN·tex-1)。 中 棉 所12 的 断 裂 比 强 度 为28.01 cN·tex-1, 对应的F1增加至31.46 cN·tex-1;鄂抗棉9 号纤维断裂比强度为27.34 cN·tex-1,对应的F1增加了5.34 cN·tex-1;断裂比强度高于鄂抗棉9 号的骨干亲本的F1断裂比强度增幅均小于鄂抗棉9 号的F1(表5)。
22 份母本材料的纤维断裂伸长率为4.91%~8.21%,平均为5.98%,其中荆棉4 号的断裂伸长率为8.21%,隆字棉的为4.91%。 22 个F1的断裂′伸长率为5.61%~8.22%,平均为6.79%,其中晋棉33 的F1断裂伸长率为8.22%, 锦棉2 号的F1断裂伸长率为5.61%;18 个F1的断裂伸长率增加,平均增加1.14 百分点(表5)。
对F1和母本的纤维品质进行方差分析发现:与相应母本比较,F1的纤维上半部平均长度和断裂伸长率差异极显著, 断裂比强度差异显著,长度整齐度指数和马克隆值差异不显著。
相关性分析发现,F1的衣分和母本的衣分的相关系数为0.569,达到极显著水平;F1的籽指和母本的籽指的相关系数为0.481, 显著正相关。
本研究通过PCR 分子检测证明,FBP7::iaaM基因可在IF1-1 自交后代及杂种F1中稳定遗传,能够提高衣分。FBP7::iaaM基因转入冀棉14 后,受体衣分从40.6%提高至48.0%以上、 马克隆值从5.2 降低至4.5[1]。 肖钦之[16]研究发现FBP7::iaaM基因可以提高低衣分品种的衣分。 本研究以FBP7::iaaM转基因材料IF1-1 为供体亲本, 与不同遗传背景的棉花品种进行杂交, 其中21 个杂交组合的衣分不同程度地提高, 但是FBP7::iaaM基因在不同遗传背景的棉花材料中的表现存在差异,这与已有报道结果[1,11-13]吻合。 中棉所12 的系谱材料中,衣分比中棉所12 高的材料,其F1增幅均低于中棉所12 的F1。 鄂抗棉9 号及其骨干亲本的大多数材料也有类似趋势。 晋棉20和鄂抗棉9 号衣分分别为44.91%和42.69%,转入FBP7::iaaM基因后,其F1衣分反而略有降低;鄂荆1 号衣分为44.30%,其F1衣分明显提高,说明利用FBP7::iaaM基因提高衣分还是需要对受体材料进行选择。 此外,母本材料和相应的F1纤维品质分析结果表明,部分材料F1的纤维品质指标不同程度地提高。 这说明结合有效的育种选择, 利用FBP7::iaaM基因提高衣分同步改良品质是可能的[11,16]。
衣分和籽指可能存在负相关,FBP7::iaaM基因会使棉花种子质量变小,籽指下降。季灵艳[22]研究发现,转iaaM基因材料IF1-1 的种仁棉酚含量显著低于对照材料。 陈旭升等[23]研究表明,转iaaM种质的籽指偏小,种子空瘪率上升。 本研究发现,23 份F1材料中仅晋棉20 的F1籽指较母本有所提高, 原因是晋棉20 籽指较低仅为9.73 g。相关性分析发现,F1籽指与母本籽指呈显著正相关;因此,在利用FBP7::iaaM基因时应选择籽指较高的材料作为母本。
发芽试验结果显示,F1的发芽率和发芽势与母本的无显著差异,说明一定范围内籽指降低不影响种子发芽率和发芽势。FBP7::iaaM基因的转入是否会影响棉铃种子数和不孕籽率有待于后续试验验证。
综上所述,转FBP7::iaaM基因的IF1-1 种质系可提高部分杂种后代的纤维品质和产量性状,在同步改良棉花纤维品质和产量方面有重要的利用价值。