益心泰有效组分对慢性心力衰竭兔心肌组织TGFβmRNA及蛋白表达的影响

魏佳明，李 雅，郭志华，匡 琳，李 卉

（1.湖南中医药大学 第一中医临床学院， 湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学 药学院， 湖南 长沙410208；3.湖南中医药大学 中医学院， 湖南 长沙 410208）

慢性心力衰竭（chronic heart failure, CHF）是心室充盈或射血能力受损的一组复杂综合征，其发病率、死亡率高，造成了严重的医疗负担[1-3]。心肌重构是心衰临床进展的关键机制，而心肌纤维化是心肌病理性重塑的重要基础[4-5]。近年来大量研究显示，转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）过度表达是导致心肌纤维化的主要原因之一[6-8]。益心泰由黄芪、丹参、红花、猪苓、泽泻等药配伍组成，具有药效物质基本明确、作用机理相对清晰及安全有效、质量可控等特点。研究表明，益心泰有效组分（effective components of Yixintai，ECYXT）具备抗心室重构功能，且能保护心肌纤维[9]，但其作用机制尚不清晰。因此，本研究以兔慢性心衰模型为研究对象，采用益心泰有效组分进行干预，观察干预后兔心率、尿量及E/A比值等指标的变化，并检测心肌组织TGF-β mRNA及蛋白表达水平，深入研究益心泰有效组分对慢性心衰兔的作用机制，为其防治心衰提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 120只健康新西兰兔，普通级，体质量为1.5 ～ 2.0 kg，雌雄各半。购于湖南太平生物科技有限公司，动物许可证编号：SCXK（湘）2015-0004，合格证号：NO.43608300000615。不限制食水，通风，室温约23℃，湿度50% ～ 60%，正常光/暗周期，分笼饲养。实验得到湖南中医药大学动物实验伦理审查委员会批准（LL2018010801）。

1.1.2 实验药物 黄芪、丹参、红花、猪苓、泽泻等购于湖南中医药大学第一附属医院（经湖南中医药大学郭志华教授鉴定，符合《中国药典》2020年版一部规定），按照3∶1∶1.5∶1∶1配比，采用系统溶剂法与大孔树脂吸附法相结合，对益心泰复方中四个不同极性部位的药效组分进行分离，根据最佳工艺条件，分离得到益心泰有效组分提取液，冷冻干燥得提取物（含总皂苷372.4 mg/g、总黄酮98.3 mg/g、总多糖445.8 mg/g）；氯沙坦钾（50 mg/片，杭州默沙东制药有限公司，批号：H20000371）；丙基硫氧嘧啶（50 mg/片，苏州东瑞制药有限公司，批号：H32020795）；乌拉坦（美国Sigma公司，批号：94300）；生理盐水（500 mL/瓶，四川科伦药业股份有限公司，批号：H51021158）。

1.1.3 试剂 多聚甲醛（批号：16005）、苏木精（批号：H9627）、伊红（批号：E4009）、Pluronic-F127（批号：P2443）等购自美国Sigma公司；石蜡购自河南天孚化工有限公司；TGF-β抗体（批号：#3711）购自美国Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗体（批号：ab181602）购自艾博抗（上海）贸易有限公司；RIPA裂解液、PMSF、BSA蛋白定量试剂盒等购自北京索莱宝生物科技有限公司；反转录试剂盒（批号：RR047A）、SYBR Premix EX Taq TM II（ 批号：DRR820A）等购自日本Takara公司；TrIzol试剂（批号：15596-026）购自美国Invitrogen公司；Fluo3/AM（批号：S1056）购自上海碧云天生物技术公司。

1.1.4 仪器 Sequoia 512型超声心动图机（德国西门子公司）；FV3000型激光扫描共聚焦显微镜（日本奥林巴斯公司）；DYY-7C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；SYSTEM GelDoc XR+型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；iQ5型PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备 参考文献[10]，采用阿霉素耳缘静脉注射+丙基硫氧嘧啶灌胃制作心衰兔模型。根据随机原则，将20只实验兔作正常对照组，余下100只进行造模处理。固定兔于手术台，模型兔予丙基硫氧嘧啶灌胃，剂量按兔每日进食量的0.2%，每日1次；并分别于每周三、周日下午耳缘静脉注射阿霉素溶液1 mg/kg，浓度为1 mg/mL。正常对照组予等次等量的生理盐水灌胃与耳缘静脉注射。连续造模8周。

1.2.2 干预方法 将造模成功的模型兔按完全随机设计方法分为HF模型组（17只）、益心泰有效组分低剂量组（17只）、中剂量组（17只）、高剂量组（17只）和氯沙坦钾组（16只），另设正常对照组（20只），一共为6组。于造模后第1周开始灌胃，根据成人体表面积换算法，结合临床用药经验和既往实验研究，确定益心泰有效组分低、中、高剂量组分别按照2.1 g/kg、4.2 g/kg、8.4 g/kg，给药前予以蒸馏水稀释后灌胃。氯沙坦钾组（制作成氯沙坦钾悬液）按照2.75 mg/kg，正常对照组与HF模型组灌服同等容积的蒸馏水，各组灌胃量均为每次10 mL/kg，均每日1次，连续4周。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 一般情况 观察兔的毛色、精神状态、活动度、心率、尿量、水肿等一般情况。

1.3.2 E/A比值检测 麻醉完成后将兔平卧位固定，超声心动图机探头频率3～8 MHz，取心前区左室长轴最大直径处，M型超声标记室间隔和左室后壁收缩末与舒张末期心内膜位置，随机软件自动计算兔E/A比值，取5个心动周期读数平均值。

1.3.3 TGF-β mRNA检测 RT-PCR法测定心肌组织TGF-β mRNA水平，TRIzol抽提总RNA，计测OD值，检测RNA的纯度及浓度并定量。逆转录合成cDNA：配置逆转录反应体系（20 μL），用去离子水1∶3稀释后贮存于-20℃冰箱备用。引物设计与合成：TGF-β：F:5´-AACTACTGCTTCAGCTCCAC-3´；R:5´-GTAACACGATGGCGAGTGCG-3´。PCR反 应体系：配置逆转录反应体系（20 μL），置于PCR仪中，95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，步骤2—4循环40次，72℃ 10 min。PCR产物长度为250 bP。1.3.4 TGF-β 蛋白检测 采用Western blot法测定，液氮研磨心肌组织后，加入裂解液，冰上放置20 min，充分裂解，4℃，12 000 r/min，离心15 min，取上清，BCA法蛋白定量，制备SDS-PAGE浓缩胶与分离胶，上样，电泳，转膜，封闭，配一抗，上一抗，上二抗，显影成像，利用Quantity-One 图像分析软件分析各样品目的条带的灰度值，以看家基因GAPDH为内对照，计算TGF-β蛋白条带与GAPDH条带灰度值之比，并将基础数值（正常对照组）设置为“1”进行比较，从而得出各组最后结果。

1.4 统计学方法

用SPSS 21.0软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差±s）表示，多组间比较采用方差分析。以P< 0.01为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 ECYXT对慢性心衰兔一般情况的影响

用药后，各用药组兔毛毛色枯槁、精神萎靡、少动少气、水肿及心率加快、尿量减少（心率、尿量情况详见表1）等症状均有所改善，以中、高剂量组和氯沙坦钾组较明显。HF模型组没有明显的改变，并且其中部分实验兔较前严重。用药干预全过程中，HF模型组和低剂量组兔各死亡3只（均死于腹泻），中剂量组兔死亡2只（均死于腹泻），高剂量组、氯沙坦钾组各死亡1只（均死于腹泻），正常对照组无死亡。

2.2 ECYXT对慢性心衰兔心率、尿量、E/A比值的影响

用药后，与正常对照组比较，HF模型组心率加快、尿量减少（P< 0.01），E/A比值下降（P< 0.01）；与HF模型组比较，各给药组心率降低、尿量有所增加（P< 0.01），E/A比值上升（P< 0.01）；与低剂量组比较，中、高剂量组和氯沙坦钾组心率降低、尿量增加（P< 0.01），E/A比值升高（P< 0.01）；而中、高剂量组与氯沙坦钾组心率、尿量、E/A比值比较，差异均无统计学意义（P> 0.05），结果见表1。

表1 ECYXT对慢性心衰兔心率、尿量、E/A比值的影响（±s）Tab. 1 Effects of ECYXT on heart rate, urine volume and ratio of E/A in CHF rabbits（ ±s）

表1 ECYXT对慢性心衰兔心率、尿量、E/A比值的影响（±s）Tab. 1 Effects of ECYXT on heart rate, urine volume and ratio of E/A in CHF rabbits（ ±s）

注：与HF模型组比较，△△P < 0.01；与益心泰有效组分低剂量组比较，**P< 0.01。

正常分 对组照组 2 n 0 21（1.2次心0 ±率/m 5 i./n9）4△△** 0.9（7尿m±L量0./0h/3）△△** 1.49 ±Em /0Am.0/4△△**HF 模型组 14 234.79 ± 5.85 0.62 ± 0.02 0.60 ± 0.02益心泰有效组分14 224.07 ± 5.48△△ 0.67 ± 0.02△△ 0.68 ± 0.02△△益心低泰剂有量效组组分15 218.07 ± 5.88△△** 0.90 ± 0.02△△** 1.22 ± 0.03△△**益心中泰剂有量效组组分16 217.13 ± 6.31△△** 0.91 ± 0.03△△** 1.23 ± 0.04△△**高剂量组氯沙坦钾组 15 215.27 ± 5.50△△** 0.92 ± 0.03△△** 1.24 ± 0.03△△**F 31.14 584.16 1 940.07 P 0.000 0.000 0.000

2.3 ECYXT对慢性心衰兔心肌组织TGF-β mRNA及蛋白表达的影响

与正常对照组比较，HF模型组TGF-β mRNA水平升高（P< 0.01）；与HF模型组比较，各用药组TGF-β mRNA水平均降低（P< 0.01）；与低剂量组比较，中、高剂量组和氯沙坦钾组心肌组织TGF-β mRNA水平均降低（P< 0.01）；而中、高剂量组与氯沙坦钾组心肌组织TGF-β mRNA水平比较，差异均无统计学意义（P> 0.05）。

与正常对照组比较，HF模型组TGF-β 蛋白表达升高（P< 0.01）；与HF模型组比较，各用药组TGF-β蛋白表达均降低（P< 0.01）；与低剂量组比较，中、高剂量组和氯沙坦钾组心肌组织TGF-β蛋白表达均降低（P< 0.01）；而中、高剂量组与氯沙坦钾组心肌组织TGF-β蛋白表达比较，差异均无统计学意义（P> 0.05），结果见图1、表2。

图1 ECYXT对慢性心衰兔心肌组织TGF-β蛋白表达的影响Fig.1 Effects of ECYXT on the expression of TGF-β protein of myocardial tissue in CHF rabbits

表2 ECYXT对慢性心衰兔心肌组织TGF-β mRNA及蛋白表达的影响（±s）Tab. 2 Effects of ECYXT on the expression of TGF-β mRNA and protein of myocardial tissue in CHF（±s）

表2 ECYXT对慢性心衰兔心肌组织TGF-β mRNA及蛋白表达的影响（±s）Tab. 2 Effects of ECYXT on the expression of TGF-β mRNA and protein of myocardial tissue in CHF（±s）

注：与HF模型组比较，△△P< 0.01；与益心泰有效组分低剂量组比较，**P< 0.01。

分组 n TGF-β mRNA TGF-β蛋白正常对照组 20 1.12 ± 0.03△△** 1.00 ± 0.03△△**HF模型组 14 3.06 ± 0.09 3.17 ± 0.09益心泰有效组分低剂量组 14 2.97 ± 0.08△△ 2.74 ± 0.08△△益心泰有效组分中剂量组 15 1.55 ± 0.05△△** 1.55 ± 0.04△△**益心泰有效组分高剂量组 16 1.53 ± 0.04△△** 1.52 ± 0.04△△**氯沙坦钾组 15 1.52 ± 0.03△△** 1.53 ± 0.04△△**F 3 313.93 3 528.82 P 0.000 0.000

3 讨论

慢性心力衰竭的重要病理机制是心肌重构[11]，在心肌重构发生发展过程中TGF-β过度表达所致的心肌纤维化为其始动因素。益心泰的临床用药表明其具有抗心室重构、改善心衰的作用，组方中的黄芪、红花、丹参等药有明确的下调TGF-β表达，减轻心肌纤维化的功效[12-14]，且前期网络药理学发现TGF-β为益心泰治疗心衰的关键节点[15]。因而推测，益心泰可作用于TGF-β，减轻心肌纤维化程度，进而达到改善心衰的效果。

本研究中HF模型组较正常对照组心率加快、尿量减少、E/A比值下降，提示CHF兔心衰的形成。从本研究结果可以看出，益心泰有效组分的使用可以提高CHF兔的心功能、改善心衰，其作用机理可能与下调TGF-β mRNA及蛋白表达，进而干预成纤维细胞增殖、生长因子的表达及调节细胞的增殖黏附与迁移等过程有关[16]。且益心泰有效组分中、高剂量组下调TGF-β mRNA及蛋白表达能力和改善心衰疗效强于低剂量组。

4 结论

本研究通过观察益心泰有效组分对慢性心力衰竭兔模型的干预作用，比较了各组兔心率、尿量、E/A比值、心肌组织TGF-β mRNA及蛋白表达等指标，表明益心泰有效组分提高心功能、改善心衰的机制可能与抑制TGF-β mRNA及蛋白表达有关。考虑到心衰发病机制的复杂性以及中药复方多途径、多靶点的作用特性，对益心泰有效组分治疗心衰的机制仍需进行更全面、深入的研究，以便更好地应用于临床。