牛、羊奶中莫昔克丁残留高效液相色谱荧光检测方法的建立

沈 昕，张玉洁，李 丹，孙红洋，朱馨乐，黄耀凌

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

莫昔克丁，又称莫西菌素，是一种由链霉菌发酵产生的结构单一的大环内酯类抗生素，为米尔贝霉素类药物[1-2]，20世纪80年代中期开始在畜牧业中被作为驱虫药应用，具有高驱虫活性、长效性及安全性的特点，莫昔克丁在较低剂量下即对线虫和节肢动物有明显杀灭作用[3-5]。由于莫昔克丁在结构上缺少一个二糖取代基，因此,脂溶性较好，同时也易溶于水。试验证明，用药后莫昔克丁在脂肪组织中分布较高，在肌肉与肾脏中分布较低，主要以药物原形为其残留方式[5-6]。有资料表明，莫昔克丁在组织内停留时间较长，而乳汁也是其主要排泄途径之一，人类若长期食用含有莫昔克丁残留的奶制品，会对其健康造成很大的威胁，因此，制定合理的休药期及高效、灵敏的检测方法十分必要。我国2019年发布的《GB 31650-2019 食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》中规定，牛、羊奶中莫昔克丁的最高残留限量(MRL)为40 μg/kg[7]，但目前国内外关于莫昔克丁的检测方法报道较少[8-11]，我国也没有相应残留检测方法的国家标准。高效液相色谱法具有快速、灵敏的优点，且现在国内已基本普及，因此，建立一个高效、灵敏的液相色谱法对于更好的监测莫昔克丁在畜牧业中的合理化应用有着重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器设备 Agilent高效液相色谱仪(配荧光检测器)，美国安捷伦公司；XS105DU分析天平，Mettler Toledo公司；AE260电子天平，Mettler Toledo公司；MS3涡旋混合器，ks 501 digital 振荡器，IKA 公司；FV64氮吹仪，得泰仪器公司；Biofuge Strators 高速冷冻离心机，贺利氏公司；LC-213鼓风干燥箱,上海爱斯佩克环境仪器有限公司。

1.2 药品与试剂 莫昔克丁，含量≥94%，Dr.Ehrenstorfer；三乙胺；三氟乙酸酐；N-甲基咪唑；冰醋酸；乙腈、甲醇均为色谱纯。

1.3 溶液的配制

1.3.1 标准溶液的配制 莫昔克丁标准储备液(1 mg/mL)：精密称取适量莫昔克丁标准品于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，成为浓度1 mg/mL的标准储备液；量取适量标准储备液，用乙腈稀释为10 μg/mL 的标准工作液。

1.3.2 衍生化试剂的配制 A液：N-甲基咪唑-乙腈(1+1，V/V)，现用现配；B液：三氟乙酸酐-乙腈(1+2，V/V)，现用现配。

1.4 液相色谱条件 色谱柱：Phenomenonx luna C18， 250 mm × 4.6 mm(i.d), 粒径5 μm；流动相：乙腈+水(90+10，V/V)；流速：1.8 mL/min；检测波长：激发波长为365 nm，发射波长475 nm；柱温：40 ℃；进样量：20 μL。

1.5 标准曲线及线性范围的测定 精密量取莫昔克丁标准工作液适量于容量瓶中，用乙腈稀释成浓度为4、10、20、100、200和500 ng/mL的系列标准工作液。取以上6个浓度的标准工作液各1.0 mL于各自的10 mL试管中，于50 ℃水浴氮气吹干，按衍生化步骤处理后，供高效液相色谱仪测定。从低浓度到高浓度依次测定，每一浓度进样3针。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。

1.6 样品前处理 提取：称取牛(羊)奶(2±0.02) g于50 mL离心管中，加乙腈3 mL，涡旋混匀，中速振荡5 min，10000 r/ min离心5 min，收集上清液于另一50 mL离心管中。残渣再重复提取一次。合并两次上清液，加水3 mL，混匀，备用。

净化与浓缩：C18固相萃取柱依次用乙腈 5 mL和30%乙腈水溶液 5 mL活化，将备用液过柱，用30%乙腈水溶液 5 mL淋洗，抽干。用乙腈5 mL洗脱，收集洗脱液于10 mL试管中，50 ℃水浴氮气吹干。备用。

衍生化：向试管中依次加入衍生化试剂A液100 μL和衍生化试剂B液150 μL，密闭，涡动10 s，依次加冰醋酸、三乙胺各50 μL，涡动10 s，65 ℃避光密闭反应15 min，取出后加650 μL甲醇混匀。经0.45 μm微孔滤膜过滤，供高效液相色谱仪检测。

1.7 方法灵敏度的确定 分别对北京超市购置的不同品牌的牛、羊奶进行筛选，所得空白样品进行添加回收试验，按照上述样品前处理方法处理，进行HPLC 分析，测得药物色谱保留处的基线噪音值，求其平均值。以S/N≥3作为该方法药物的检测限；以S/N≥10，且在该添加水平的回收率和变异系数均满足残留分析要求的最小浓度作为定量限(LOQ)。

1.8准确度和精密度的测定 采用标准添加法，在空白牛奶、羊奶中分别添加定量限、1/2 MRL、MRL和2 MRL四个浓度(5、20、40、80 μg/kg)的莫昔克丁标准工作液进行回收率试验，各浓度进行5个样品平行试验，同时重复3次空白试验，求每个样品的回收率和批内、批间相对标准偏差(RSD)。

2 结果与分析

2.1 标准曲线及线性范围 取4、10、20、100、200和500 ng/mL标准溶液浓度点进行检测，莫昔克丁在该浓度范围内呈良好线性关系，回归方程为y=0.3303x- 0.6572,R2= 0.9998。

2.2方法灵敏度 按照本文建立方法，添加莫昔克丁浓度为2 μg/kg时，S/N≥3，添加莫昔克丁浓度为5 μg/kg时，S/N≥10，因此，本方法检测限为2 μg/kg，定量限为5 μg/kg。标准对照液、空白牛奶及添加试样中的高效液相色谱图见图1。

(A)莫昔克丁标准溶液色谱图(10 ng/mL) (B)空白牛奶试样色谱图(C)空白牛奶添加莫昔克丁试样色谱图(5 μg/kg)

2.3 方法准确度和精密度 根据莫昔克丁在牛、羊奶中MRL规定，在空白试料中添加定量限、1/2 MRL、MRL和2 MRL四个浓度的莫昔克丁，进行回收率试验，每个浓度设置5个平行样品，并重复3次，按照上述方法处理后，高效液相色谱(荧光检测器)检测。分别计算回收率以及批内、批间变异系数，结果见表1、表2。

表1 空白牛奶中添加莫昔克丁的回收率测定结果(n= 5)

表2 空白羊奶中添加莫昔克丁的回收率测定结果(n= 5)

结果表明：本方法在5～ 80 μg/kg 添加浓度范围内，牛、羊奶的回收率范围分别为75.5%～110%、77.5%～95.6%；批内变异系数分别为0.84%～7.38%，1.25%～5.06%；批间变异系数分别为3.98%～7.87%，2.62% ～5.92%。

3 讨论与结论

3.1 提取条件的优化 根据现有文献作为参考[8-12]，并根据莫昔克丁易溶于多种有机溶剂的结构性质，本方法分别选用乙酸乙酯、20%乙醇乙腈、乙腈对莫昔克丁进行提取，经试验发现，莫昔克丁用乙酸乙酯提取回收率较低，用20%乙醇乙腈、乙腈提取时，回收率均能达到80% 以上，但经进一步比较分析，用20%乙醇乙腈提取后，莫昔克丁药物峰形变宽，因此，本方法选择乙腈作为提取溶剂，并通过高速离心去除蛋白质等大量杂质的干扰，有效提取其中的莫昔克丁药物。

3.2 衍生化条件的优化 莫昔克丁为米尔贝霉素类药物，其分子结构与阿维菌素类药物十分类似，适合用高效液相色谱法进行测定。此类药物衍生化后的荧光响应值高，杂质干扰少，且相较于成本更高的液相色谱-质谱法成本低，具有更好的普适性。在目前衍生化方法中，对阿维菌素类药物的衍生化试剂普遍使用N-甲基咪唑-乙腈(1+1，V/V)和三氟乙酸酐-乙腈(1+2，V/V)进行[13]。本实验对衍生化的温度、时间、光照条件等进行了摸索。经试验比较发现，若在室温下进行衍生化，则需要较长反应时间；若在加热条件下进行，65 ℃反应15 min，即可充分衍生化。同时，在反应温度和时间一定的前提下，在正常光照和避光两种条件下，前者药物的峰面积均明显低于后者。因此，本方法选用65 ℃反应避光15 min衍生化条件。此反应条件衍生化反应效率高、反应充分、杂质干扰少，反应后的衍生产物与甲醇混合后，形成稳定的醇式衍生物，其含量稳定，保存一天以后进样，测得莫昔克丁药物峰面积与立即进样峰面积基本无变化。

3.3 色谱条件的优化 本试验经过衍生化后，基质中的干扰成分已基本去除，药物色谱峰保留时间内也无干扰。因此，在色谱条件上，本试验将流速增加至1.8 mL/min，同时将柱温升高至40 ℃，缩短了分析时间，提高了试验效率。本方法与李林霞等[8]建立的HPLC方法相比，减少了提取液用量，加快了提取液经固相萃取柱净化速度，且优化了色谱条件，加大了流速，提高了柱温，使药物保留时间由15 min提前至12 min，更好的去除了样品中杂质干扰，在缩短了试验的前处理和样品检测时间、加快了试验进度的同时，保证了样品的基质效应降得更低，为检测莫昔克丁大批量试验保证了效率和准确度。

本试验建立了牛、羊奶中莫昔克丁残留的高效液相色谱检测方法，其检测限为2 μg/kg，定量限为5 μg/kg，平均回收率范围为75.5%～ 110%，批间及批内变异系数均低于7.87%。该方法操作简单、适用性强、灵敏度高，可满足检测工作的需要。