外源钙对低温胁迫下西藏野生垂穗披碱草生理及相关基因表达的影响

其美拉姆，普布卓玛，崔彤彤，张新飞，姜惠娜，付娟娟*，呼天明*

(1.西北农林科技大学草业与草原学院，陕西 杨凌 712100；2.西藏自治区农科院草业科学研究所，西藏 拉萨 850000)

Ca2+是植物体必需的矿物质营养元素之一，在植物生长过程中起着必不可少的作用[7]。作为重要的信号物质，Ca2+在逆境胁迫下，能通过激活保护酶系统、改善光合作用等机制缓解高低温、干旱、高盐和病虫害等胁迫对植物的伤害[8-12]。而且钙可与细胞内Ca2+受体——调蛋白结合，参与胁迫信号的感受、传递、响应和表达。外源施钙可增强质膜的稳定性和钙平衡，能减轻环境胁迫对植物细胞膜的伤害[13-14]。在低温胁迫下，Ca2+不仅可以调节植物体内无机离子的运输，对维持细胞壁、细胞膜、膜结合蛋白的稳定性起着重要的作用[15-16]，而且Ca2+与受体结合可发生磷酸化级联反应将信号传递至下游胁迫响应基因，调节这些基因的表达和产物的活化，增加植株抗寒性[17]。Shi等[18]研究发现外源CaCl2能够调控植物的光合响应、氧化还原平衡、三羧酸循环等多种代谢途径，而且在胁迫相关基因诱导表达方面起着关键作用。但目前尚未见关于外源CaCl2调控西藏野生垂穗披碱草抗寒性的报道。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试野生垂穗披碱草种子于2016年采集于西藏拉萨市当雄县(91°05′ E，30°51′ N，海拔4 618 m)。种子净度为100%，种子发芽率可达到98%，种子的保存温度为4℃。

1.2 试验方法

选取颗粒饱满一致的野生垂穗披碱草种子，用1%的次氯酸钠溶液浸泡消毒5 min，用灭菌超纯水清洗数次。将种子整齐摆放在铺有双层湿润无菌滤纸(内径9.0 cm)的无菌玻璃培养皿中，将其放置在人工气候培养箱(25℃)中催芽萌发，萌发过程滤纸始终保持湿润。待幼苗长到2 cm左右时，选取长势一致的健康植株转移至铺满石英砂的培养钵中，每钵4株。将培养钵放置于恒温恒湿植物培养箱(光强12 000 lux，光期16 h，23℃，湿度80%；暗期8 h，20℃，湿度60%)中培养，培养周期时为4周，期间每2 d换1次Hogland营养液[20]。为了筛选外源CaCl2作用最佳浓度，分别设置5 mM，10 mM，15 mM，20 mM，25 mM CaCl2浓度，将植株做好标签后转移至人工4℃冰箱，早晨和晚上对植株叶面均匀喷施对应浓度的CaCl2，喷施7 d后进行株高，根长，鲜重，干重，相对电导率测定。经过预试验确定15 mM CaCl2为最佳处理浓度，试验设置4个处理CK(常温，Hogland)，CK+CaCl2(常温，15 mM CaCl2)、低温(4℃，Hogland)和低温+CaCl2(4℃，15 mM CaCl2)，每个处理设置3个生物学重复。待幼苗培养至三叶期时，进行CaCl2叶片喷施处理，每天定时喷施2次(以不滴下液体为准)，处理7 d之后采集样品进行相关生理指标测定。

胁迫相关基因和抗氧化酶基因的相对表达水平测定：分别采集4℃处理不同时间(0 h，0.5 h，2 h，6 h，12 h，24 h，72 h，120 h)的叶片样品100 mg，立刻放入液氮，使用组织研磨机研磨样品，采用RNA提取试剂盒(Takala，中国大连)提取样品中的总RNA，使用TaKaRa公司的反转录试剂盒将RNA反转为cDNA，放于—80℃保存备用。

1.3 指标测定

1.3.1形态指标测定 用直尺(精度为1 mm)测量株高和根长并记录；根、叶进行分离，去除表面水分后称重后，记各部分鲜重，生物量用单株鲜重表示(g)。然后将样品放入烘箱中110℃杀青10 min并60℃烘干48 h，称重后，记各部分干重。

1.3.3RT-qPCR测定低温相关基因及抗氧化酶相关基因的相对表达量 采用Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪进行实时定量PCR扩增。以Tublin基因为内参，用Primer 5.0软件设计引物，基因特异性引物见表1。反应体系和程序按照hamQ SYBRqPCR MasterMix试剂盒(中国南京)操作方法进行，反应程序为：95℃预变性3 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环。每个处理有3个生物学重复，每个样品有3次技术重复，采用2-ΔΔCt方法基因的相对表达量[28]。

表1 RT-qPCR引物列表

1.4 数据处理与分析

所有数据采用Microsoft Excel 2007录入，采用Origin 2020b作图，采用SPSS 22.0软件对数据进行单因素ANOVA分析，采用Duncan’s法对平均值进行多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 外源CaCl2对低温胁迫下垂穗披碱草幼苗生长的影响

由图1A和1B可知，低温胁迫抑制垂穗披碱草幼苗的生长，叶片较稀疏；而喷施CaCl2能够减轻低温胁迫对幼苗生长的抑制，表现为叶片较为密集、叶片脱水现象较轻。低温胁迫(4℃)与常温(CK)相比，株高和根长分别降低了15.07%和17.35%；低温胁迫下喷施外源CaCl2对其株高和根长影响较小，在CK条件下喷施CaCl2，与CK相比差异也不显著(图1C)。低温胁迫下垂穗披碱草幼苗地上及地下鲜重和地上及地下干重分别较CK下降了72.64%，64.7%和69.41%，76.73%(P<0.05)。低温胁迫下喷施CaCl2能够提高幼苗的生物量，其中地上及地下鲜重和地上及地下干重与低温处理相比，分别增加了164.42%，106.08%和160.88%，92.88%(P<0.05；图1D,E)。由此得出，外源CaCl2能在一定程度上缓解低温对垂穗披碱草幼苗造成的伤害。

2.2 外源CaCl2对低温胁迫下垂穗披碱草细胞膜稳定性的影响

图2 低温(4℃)胁迫下CaCl2对垂穗披碱草幼苗相对电导率(A)，丙二醛(B)，超氧阴离子自由基(C)的影响

2.3 外源CaCl2对低温胁迫下垂穗披碱草叶片中渗透调节物质积累的影响

低温胁迫(4℃)导致叶片中可溶性糖和脯氨酸含量显著上升，与CK相比分别增加了105.81%和85.53%(P<0.05；图3)。低温条件(4℃)下喷施CaCl2进一步提高了叶片中可溶性糖和脯氨酸含量，与低温(4℃)相比分别增加了61.03%和178.46%(P<0.05)。而在常温条件下喷施CaCl2，叶片中可溶性糖和脯氨酸含量差异不显著。

2.4 外源CaCl2对低温胁迫下垂穗披碱草叶片中抗氧化酶活性的影响

低温胁迫不同程度地改变垂穗披碱草叶片中抗氧化酶活性(图4)。低温胁迫(4℃)下，叶片中SOD，CAT，APX，GR活性比CK分别增加了109.41%，82.22%，53.41%和46.5%(P<0.05)，而POD活性变化不显著。低温胁迫(4℃)下喷施CaCl2进一步提高叶片SOD，POD，CAT，APX活性，与4℃相比分别增加26.80%，62.66%，20.48%和32.44%(P<0.05)，但对GR活性影响较小。在CK条件下喷施CaCl2，叶片SOD活性比CK增加了67.78%，但其他酶活性与CK相比差异不显著。

图4 低温(4℃)胁迫下CaCl2对垂穗披碱草幼苗SOD,POD,CAT,APX和GR的影响

2.5 外源CaCl2对低温胁迫下垂穗披碱草叶片中抗氧化酶相关基因表达的影响

由图5可知，随着低温时间的延长，抗氧化酶相关基因表达表现为动态变化趋势，CaCl2处理能够改变抗氧化酶相关基因的表达水平。除低温胁迫24 h外，外源CaCl2显著提高低温胁迫下EnCu/ZnSOD，EnFeSOD和EnMnSOD基因的表达水平(图5A-C)；与CAT活性变化不同的是，EnCAT2基因的表达响应在低温胁迫(24～120 h)下变化较小，而CaCl2处理显著提高低温胁迫120 h下EnCAT2基因的表达水平(图5D)；EnPER1基因随着低温胁迫时间的延长呈现先增后降的变化趋势，外源CaCl2处理下EnPER1基因的表达趋势与之相似，并在低温胁迫24 h时显著提高EnPER1基因表达量(图5E)；随着低温胁迫进程的推进，外源CaCl2处理显著提高EnAPX基因的表达(图5F)；EnGPX基因的表达水平随着低温胁迫的进程表现出下降趋势，低温24 h时外源CaCl2能显著提高EnGPX基因的表达量。EnGST4基因的表达水平随着胁迫时间表现出递减趋势(图5G)，在72～120 h外源CaCl2处理能够显著提高此基因的表达水平(图5H)；EnMDAR基因的表达水平随着低温胁迫的推移呈现先降低后升高再降低的变化趋势，外源CaCl2处理对EnMDAR基因的表达水平无显著影响(图5I)。

图5 CaCl2对低温(4℃)胁迫下3个时间点的垂穗披碱草幼苗抗氧化酶相关基因表达量的影响

2.6 外源CaCl2对低温胁迫下垂穗披碱草叶片中胁迫相关基因表达的影响

CaCl2处理能够诱导低温胁迫相关基因的表达水平发生改变。EnCBF12，EnCOR410，EnCS120，EnDHN5和EnMYB4基因的表达量在胁迫0～12 h内迅速上升，在低温胁迫24～120 h时呈现不同程度的下降趋势；外源CaCl2处理也呈现相似地变化趋势(图6)。EnSDR1基因在低温胁迫2和12 h时出现2个表达峰值；低温胁迫6 h下喷施CaCl2能显著诱导EnCS120基因的表达，与低温6 h下喷施水相比分别增加184.80%，799.58%，100.57%(P<0.05)；在低温胁迫12 h时，CaCl2处理显著诱导EnCOR410和EnDHN5基因表达，较低温处理12 h分别增加30.11%和192.40%；在低温胁迫24 h 时，CaCl2处理显著上调EnCS120和EnMYB4基因的表达，与低温处理相比分别增加173.20%和137.41%(P<0.05)。

3 讨论

3.1 外源CaCl2对低温胁迫下垂穗披碱草幼苗形态的影响

低温作为常见的非生物因素，能够影响植物超微结构、形态和生理，严重时能导致植物死亡[29]。Shi等[18]发现低温抑制了狗牙根幼苗的生长，而5～20 mM外源CaCl2能明显改善低温胁迫引起的生长抑制。与之相似，本课题组前期研究发现，低温胁迫会降低垂穗披碱草的鲜重、株高和根长[30]。本试验结果表明，在低温胁迫(4℃)下，垂穗披碱草幼苗的株高和根长、地上及地下鲜重和地上及地下干重显著低于CK；在低温条件下喷施15 mM CaCl2能够缓解低温对垂穗披碱草幼苗的生长抑制作用，提高了低温胁迫下的生物量。

3.2 外源CaCl2对低温胁迫下垂穗披碱草叶片抗氧化系统的影响

3.3 外源CaCl2对低温胁迫下西藏野生垂穗披碱草低温相关基因表达的影响

植物在遭受低温胁迫时，通过低温信号感知、传递，产生一定的生理应答响应，这个过程会引发一系列与低温胁迫应答相关的各种生理生化反应与胁迫相关的基因表达变化[43]。如R2R3型转录因子MYB4和CBFs及COR410，CS120等脱水素相关的基因能够诱导一系列的生理代谢防御响应，保护植物细胞免受低温胁迫损伤[44-46]；SDR1(dehydrogenase/reductase 1)基因编码脂肪酸脱氢酶，能够通过调节细胞膜的流动性保护植物不受低温伤害[47]。Zhu等[48]报道，Ca2+作为第二信使能够将低温信号传递到CBF-COR低温响应通路，从而调控植物的低温应答。本试验研究表明，低温胁迫处理下，外源CaCl2处理显著改变垂穗披碱草叶片中EnCOR410，EnCS120，EnDHN5和EnMYB4基因的表达。相似地，王庆杰和王立[17]研究也表明Ca2+通过诱导低温基因的表达在植物应答低温胁迫时发挥关键作用。

4 结论