重组蛋白中吐温80含量硫氰酸铵钴显色检测法的改进及验证

庞丽然，贺丞，杜力，刘国芳

华北制药集团新药研究开发有限责任公司，河北石家庄050015

药用辅料是制剂的重要组成部分，其质量和安全性直接影响制剂的有效性和安全性［1］。吐温80是一种非离子型表面活性剂，可作为稳定剂、分散剂、乳化剂或增溶剂等，多种重组蛋白药物中均以吐温80作为稳定剂。国内外均有报道吐温80可导致严重的过敏反应，也可产生呼吸困难、恶心、呕吐、皮疹等不良反应［2-3］。因此，测定吐温80含量可为重组蛋白的临床安全用药提供参考，为其质量评价提供依据。

吐温80含量常用的检测方法有硫氰酸钴铵比色法、紫外光谱法、分子排阻-蒸发光散射法、气相色谱法等［4］，《中国药典》四部（2020版）收录吐温80含量的检测方法为硫氰酸钴铵比色法［5］，该方法的原理为吐温80中的聚乙氧基可与铵钻硫氰酸盐反应形成蓝色复合物，溶于二氯甲烷，通过比色测定吐温80含量。但该方法检测范围仅为0～100 μg／mL，单抗药物蛋白浓度高，干扰大，吐温含量高，因此本实验将药典方法中高二氯甲烷的用量调整为4.00 g，硫氰钴铵溶液浓度提高3倍，并对改进后的方法进行验证，以期适用于高浓度重组蛋白药物中吐温80含量检测。

1 材料与方法

1.1 样品 重组人源抗hTNF-α单克隆抗体半成品（批号为：SY20180301，简称半成品）及重组人源抗hTNF-α单克隆抗体注射液（批号为：20180301、2018-0302、20180401）由华北制药集团新药研究开发有限责任公司提供。

1.2 主要试剂及仪器 吐温80标准品（批号：39H-0092）购自公司美国Sigma公司；二氯甲烷、硫氰钴铵及无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司；氯化钠购自天津市永大化学试剂有限公司；紫外可见分光光度计购自美国Thermo公司。

1.3 检测方法的改进 取180 μL样品，加入5 mL乙醇饱和氯化钠溶液，6 000×g离心10 min，取上清液。将上清液放入真空干燥旋转蒸发仪（参数为：40℃，蒸发1 h，压力5 mbar，安全压力限15 mbar）干燥（吐温80标准品检测不进行上述操作）；用1 mL超纯水溶解，准确加入4.00 g二氯甲烷及2 mL硫氰钴铵溶液（称取硝酸钴24.0 g、硫氰酸铵160.0 g，加超纯水溶解并稀释至200 mL），加塞混匀1.5 h（15 min／次），静置30 min；弃上层液，紫外可见分光光度计测定下层液A620［1］。

1.4 方法的验证

1.4.1 专属性 称取100.00 mg吐温80标准品，用超纯水定容至100 mL，制成1.0 mg／mL的标准品溶液。分别取1.0 mg／mL的吐温80标准品溶液、半成品及加入吐温80标准品溶液的半成品（吐温80终浓度为1.0 mg／mL），按1.3项方法进行检测。

1.4.2 线性范围 将1.0 mg／mL的吐温80标准品溶液（制备方法同1.4.1项）用超纯水稀释为0、50、100、150、200、300、400 μg／mL。分别取1.0 mL标准品稀释液，按1.3项方法进行检测，以标准品浓度为横坐标，A620为纵坐标，绘制标准曲线，获得回归方程。

1.4.3 定量限 取1 mL超纯水，按1.3项方法检测，并按下式计算定量限。

定量限=10 δ／S

式中δ为标准偏差，S为斜率。

1.4.4 精密性

1.4.4.1 重复性 称取1.00 g吐温80标准品，加超纯水定容至100 mL，制成10.0 mg／mL的标准品溶液，加入至1 mL半成品中，充分混匀，配制成吐温80终浓度分别为0.444、1.000、1.777 mg／mL的溶液，各浓度设3份样品。分别取180 μL上述溶液（吐温80标准品加入量为80、180、320 μg），按1.3项方法检测，并计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.4.4.2 日间精密性 由2名实验人员（A和B）分别于3个不同时间点配制10.0 mg／mL吐温80标准品溶液（方法同1.4.4.1项），加入至1 mL半成品中，配制成吐温80终浓度为1.000 mg／mL的溶液，取180 μL（吐温80标准品加入量为180 μg），按1.3项方法进行检测，并计算6次检测结果的RSD。

1.4.5 准确性 取10.0 mg／mL吐温80标准品溶液（方法同1.4.4.1项），加入至1 mL半成品中，充分混匀，配制成吐温80终浓度分别为0.444、1.000、

1.777 mg／mL的溶液，每个浓度设3份样品。分别取180 μL上述溶液（吐温80标准品加入量为80、180、320 μg），按1.3项方法进行检测，并按下式计算回收率。

回收率（%）=测定值／理论值×100%

1.5 方法的初步应用 用建立的方法检测批号为20180301、20180302、20180401的3批重组人源抗hTNF-α单克隆抗体注射液的吐温80含量。

2 结果

2.1 方法的验证

2.1.1 专属性 半成品的A620＜0.006，加入吐温80标准品溶液的半成品（吐温80终浓度为1.0 mg／mL）及1.0 mg／mL的吐温80标准品溶液A620分别为0.102和0.594，在620 nm处有明显吸收，表明该方法具有良好的专属性。

2.1.2 线性范围 吐温80的标准曲线见图1。吐温80标准品浓度在0～400 μg／mL范围内与A620呈良好的线性关系，回归方程为y=0.000 6x-0.0034，R2=0.999。

图1 吐温80的标准曲线Fig.1 Standard curve of Tween 80

2.1.3 定量限 吐温80含量的硫氰酸铵钴显色检测法的定量限为22.69 μg／mL。

2.1.4 精密性

2.1.4.1 重复性 吐温80加入量为80、180、320 μg时，各浓度3次测定结果的RSD分别为1.20%、0.94%、0.52%，均＜3.00%，见表1。表明该方法具有良好的重复性。

表1 重复性验证结果Tab.1 Verification for reproducibility

2.1.4.2 日间精密性 实验人员A于3个时间点的检测结果分别为179.44、179.11、182.22 μg／mL，实验人员B于3个时间点的检测结果分别为178.78、181.89、181.88 μg／mL，6次检测结果的RSD为0.89%，＜5.00%。表明该方法具有良好的日间精密性。

2.1.5 准确性 吐温80加入量为80、180、320 μg时的回收率分别为100.00%、98.76%、99.31%，均在80%～120%范围内，见表2。表明该方法具有良好的准确性。

表2 准确性验证结果Tab.2 Verification for accuracy

2.2 方法的初步应用 批号为20180301、20180302、20180401的重组人源抗hTNF-α单克隆抗体注射液中吐温80的含量分别为0.95、1.00和1.02 mg／mL，分别为标示量的95%、100%和102%，表明该方法能准确测定吐温80的含量。

3 讨论

吐温80具有良好的稳定性及增溶性，在药物制剂中，尤其是注射剂中得到广泛应用［6］。蛋白质具有复杂的结构，其稳定性高度依赖于外部（如环境和温度）和内部（疏水性、分子大小、pI等）因素，确保药物制剂中蛋白质稳定性的方法有多种，为防止聚集和变性，可在配方中加入表面活性剂，最常用的为吐温20和吐温80，可保护蛋白质免受界面应力的影响。有研究表明，与吐温20比较，吐温80对单克隆抗体制剂具有更好的抗聚集保护作用，引起的结构干扰较小，具有较弱的结合亲和力和较少的结合位点，是首选的表面活性剂［7］。

吐温80是一种结构相关成分高度非均相混合物，其结构异质性、存在的降解物和其他杂质及降解趋势将直接影响其在生物制药产品中的功能特性［8］。吐温80降解可能引起颗粒形成，是含有吐温80的生物治疗制剂质量和潜在安全影响因素之一［9］；吐温80水溶液易发生降解，水解释放出游离脂肪酸、聚氧乙烯（异）山梨醇酐，酯类在光或过渡金属的催化下发生自动氧化，生成过氧化物等氧化产物［10］；降解引起的吐温80含量变化与水解或氧化产物的生成，将影响蛋白制剂的稳定性、药效与用药安全性［11］。有研究通过高分辨率质谱结合快速氢／氘交换法分析吐温80［12］；WANG等［13］通过超高效液相色谱-高分辨质谱法对吐温80的10种共211个组分进行了质谱鉴定，并应用核磁共振进行了确证。高分辨率质谱及核磁共振技术有助于组分比的量化，对吐温80引起的不良生物反应进行评估［14］。

本实验对优化的重组蛋白中吐温80含量的硫氰酸铵钴显色检测法进行了验证，结果表明，该方法在吐温80标准品浓度为0～400 μg／mL范围内，与A620呈良好的线性关系，定量限达22.69 μg／mL，且具有良好的精密性及准确性。3批重组人源抗hTNF-α单克隆抗体注射液中吐温80残留量检测结果与标示量相近。除了检测吐温80的含量，还应对其稳定性及产物进行监测，有报道表明，含吐温80的注射剂可引起血压降低、心率加快、溶血、过敏、类过敏反应等［15-16］。本研究建立的硫氰酸铵钴显色法可用于重组人源抗hTNF-α单克隆抗体注射液中吐温80含量的检测，也为其他重组蛋白中吐温80含量的检测提供了实验依据。