免疫荧光法诊断猪流行性腹泻的探讨

门娟娟

（山东省高密市醴泉街道畜牧兽医站 261512）

猪流行性腹泻主要是猪流行性腹泻病毒导致的一种猪肠道传染病，此病可使猪出现呕吐、腹泻及脱水症状，近年来，随着我国猪养殖业的规模逐渐扩大，此传染病的发病率有所上升。其症状表现、流行病学、病毒形态学及病理变化等方面与猪传染性胃肠炎非常相像，所以对猪流行性腹泻的诊断存在一定难度，需要通过实验室检验的方式对病猪进行检查，从而科学的进行猪流行性腹泻诊断，为病猪有效治疗提供依据。

1 免疫荧光法概述

1.1 概念

免疫荧光法主要是将免疫学法同荧光标记技术相结合来对特异蛋白抗原在细胞内部中的分布进行研究的一种检测方法。因荧光素能发出荧光，并且在荧光显微镜下能被检出，所以可以对抗原实施细胞定位，通过免疫荧光技术对细胞或者说细胞组织内部的抗原及半抗原物质显示和检查，故称之为免疫荧光细胞化学技术。

1.2 应用方法

本次主要是观察免疫荧光法诊断猪流行性腹泻的效果，所以选取的检验对象应为病猪，需要对病猪实施解剖操作，并取部分小肠，将其作为冰冻切片，也可以选取小肠黏膜进行抹片，然后将获取的标本防治在自然环境之中自然风干，完成风干操作后需要通过丙酮对其实施固定，然后将荧光抗体加入完成染色操作，染色程序如下。

（1)标准养性抗原片以及阴性抗原片通过0.01MPBS（pH7.4)进行预湿。

（2)应将被检血清进行稀释，并向涂片地价，然后放置37℃的恒温盒之中感做30min。

（3)使用浓度为0.1%吐温80的0.01MPBS（pH7.4)清洗4次，每次清洗持续10min，然后使用无离子水及PBS再次清洗，清洗次数各1次。

（4)滴加浓度为0.1%的伊文思蓝溶液，将猪IgG荧光抗体进行稀释，然后将其涂于标本上，并将其置放在37℃恒温盒之中进行染色，染色持续时间为30min。

（5)使用0.01MPBS（pH7.4)清洗3次，清洗时间分别为3、5和8min，然后使用无离子水清洗1次。

（6)滴加碳酸缓冲甘油，并封片。

完成染色操作后需要对其全面水洗，水洗完成后需要对其封盖进行镜检，并得出相应的检验结果，除此之外，还应对病猪进行电镜检查，从而同免疫荧光法的检验结果进行对比。

1.3 判定标准

可以采用荧光显微镜对涂片进行观察，当阴性血清和阳性血清与PBS对照之后均符合的情况下可以通过标准养性抗原片上面的肠绒毛上皮细胞胞浆内部的荧光亮度进行判定，判定方法是观察荧光亮度强弱。若荧光呈现闪亮绿色荧光的情况下，则可以将其判定为强阳性；若荧光呈现明亮及普通绿色，则可将其判定为阳性；若荧光呈现出比较弱的绿色，则可判定为弱阳性；若荧光呈现出微弱绿色，则可将其判定为疑似病例；若荧光呈现为红色，则可将其判定为阴性。

2 案例分析

2.1 案例概况

某种猪养殖场共养殖种猪1263头，在养殖的过程中发现个别种猪出现呕吐、腹泻、食欲不振等症状，养殖场负责人张某立即采取隔离措施，将出现症状的种猪单独隔离于隔离观察区，并对病猪之前所处环境进行消毒。由于发现症状的78头种猪之前与猪群混养，故需要做好相关的隔离措施。与此同时，张某因怀疑种猪患得猪流行性腹泻，故立即向当地动物检疫部门报告备案，由当地动物检疫部门携带检疫设备和试剂前来该养猪场进行检疫工作。

2.2 诊断过程

养殖场负责人张某在养殖过程中发现猪群中个别种猪出现呕吐、腹泻、食欲不振、脱水等一系列症状，初步怀疑种猪患传染性胃肠炎，为了避免传染同圈的其他种猪，张某立即采取了隔离查看措施，2d后脱水种猪死亡，张某见状立即向其所在地防疫部门说明情况，由上级部门委派专业防疫人员前往该养殖场参与检疫工作，通过防疫人员根据种猪的临床症状观察，初步怀疑种猪患有流行性腹泻或者是传染性胃肠炎，为了对患病种猪进一步确诊，对该猪场已死亡种猪共22例实施实验室检验，所采用方法即免疫荧光法，检测流程与上述方法内容一致。最后将诊断结果与病理诊断进行对比。

2.3 检测结果

此次采用免疫荧光法进行检测，检测的目标为猪流行性腹泻病毒，通过全面的排查，得出的检测结果如附表所示。

由附表可知，该种猪养殖场死亡病猪中阴性及疑似病例无，可见所有种猪均可能患有猪流行性腹泻，对于22病死猪又进行了病例诊断，经病理诊断得出确诊病例为21例，免疫荧光法诊断准确率可达95.45%。此结果说明针对猪流行性腹泻采取免疫荧光法进行诊断能获取良好的诊断效果。

附表 种猪养殖场免疫荧光法检测结果 单位：%

3 讨论

猪流行性腹泻是一种高发性传染病，发病后主要症状为腹泻，并且疫情传播速度比较慢，在诊断方面容易与其他疾病之间混淆，尤其是猪养殖时容易出现的传染性胃肠炎等病，两种疾病的相似度比较高，所以在实际养殖过程中，若猪出现以上症状容易误诊，所以在对病猪诊断时，不应仅依赖于病猪临床症状和流行病学对其进行确诊，还应通过实验室检验的方法提升诊断有效性和真实性[1]。

当前针对猪流行性腹泻的诊断手段很多，如病毒分离鉴定、微量血清中和试验、电镜检查、免疫荧光法检测等，这些方法已经得到普及推广的诊断方法是电镜检查和免疫荧光法，这两种方法虽然在试验操作严格性方面表现一般，但对操作人员的熟练度和专业度方面要求比较低，可以推广。在两种方法中，电镜法的操作非常简便，且可以获取直观的定性结果，但仪器设备价格方面比较昂贵，且检测报告结果需要在3～7d内才能形成，容易导致传染病传播蔓延。但免疫荧光法这种诊断方法则能在非常短的时间内将相关检测结果得出，并且不会与轮状病毒、传染性胃肠炎病毒、大肠杆菌及猪细小病毒等混淆，所以免疫荧光法检测的结果更准确，在此次观察试验中，通过案例调查分析得出，该养殖场通过免疫荧光法共检测阳性病例22例，通过病理诊断得出确诊病猪共21例，准确率高达95.45%。说明免疫荧光法的诊断准确率非常高，适合在猪养殖场推广使用[2]。

在此次观察试验中需要说明的是，免疫荧光法在操作过程中主要以病猪小肠等相关部位取样当作检验标本，所以免疫荧光法检验并不能在疾病初诊阶段全面应用，但由于猪流行性腹泻是一种传染性疾病，需要病猪死亡后及时对病死猪进行检查，从而如实反映其死因，更重要的是当病猪出现症状后，需要养殖人员立即采取隔离措施，并加强监控，以免造成疾病蔓延，同时，还需要根据免疫荧光法检测结果对其他猪群作出有效的治疗干预，以保证猪群安全，防止此病传染蔓延。

总而言之，免疫荧光法在对猪流行性腹泻诊断有突出效用，基于此病传染性这一特点及免疫荧光法自身的优势，可将其在猪养殖方面全面推广应用，从而能及时、有效的保证疾病得到控制，促进养殖安全。