手性农药水胺硫磷对浮游生物氧化应激的对映体选择性影响

李玲，李俊杰，王俊英，黄沛玲

华侨大学化工学院，厦门 361021

随着化工制造业的迅速发展，很多手性农药正在不断开发。目前在中国，超过40%的农药是手性的，预计这一比例还会增加[1]。但是目前手性农药对映体的分离和制备难度比普通化合物要高得多，因此大部分手性农药仍以外消旋体形式生产、销售和使用。而大量研究结果表明，当手性农药的对映体进入生物体内时，由于生物体对各手性异构体识别能力的差异，以及不同靶标位点对各异构体的匹配性不同，使得异构体之间在生物活性、环境行为和毒理学等方面均可能存在差异[2]。因此，从对映体层面研究手性农药的环境行为及生态效应具有重要意义。

水胺硫磷(isocarbophos, ICP)是一种高效广谱的有机磷杀虫剂，对螨类及鳞翅目、半翅目害虫具有良好的防治效果。ICP具有一个磷手性中心，结构式如图1所示。Lin等[2]研究(+)-ICP和(-)-ICP对大型蚤的48 h-LC50相差近50倍。Lu等[3]通过测定藻类生长抑制率、叶绿素含量、总可溶性蛋白质和超氧阴离子自由基含量，发现ICP对斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)在剂量-效应关系上具有对映体选择性毒性。Liu等[4]以HepG2细胞作为体外模型，研究发现，(-)-ICP对肝细胞的毒性比(+)-ICP高2倍；还发现(-)-ICP上调Bax蛋白表达和下调Bcl-2的表达水平，导致Bax/Bcl-2比值增加，继而导致细胞活力降低和细胞凋亡。朱欣凯[5]研究发现，(+)-ICP和(-)-ICP对东亚飞蝗(Locustamigratoriamanilensis)的LD50分别为0.609 mg·kg-1(虫体质量)和79.412 mg·kg-1(虫体质量)，相差130倍。由此可见，ICP对水生生物可能会产生对映体选择性毒理效应。因此，从对映体层面来研究手性农药ICP的环境行为及生态效应具有重要意义。

水生生态系统中的初级生产者藻类对毒物比较敏感，大型蚤是被国际公认的标准毒性试验生物。本课题选择浮游植物水华微囊藻(Microcystisflos-aquae)和浮游动物大型蚤(Daphniamagna)作为受试生物，研究ICP对不同营养级浮游生物抗氧化酶毒性的对映体选择性差异，为全面评估手性有机磷农药残留对生态系统的生态毒理效应提供科学依据，同时也为有机磷农药的合理利用与污染防治提供理论支持。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 供试溶剂及仪器

ICP，纯度为99.5%，北京坛墨质检科技有限公司。ICP的2个对映体由实验室自制，两者纯度≥98.0%。丙酮、正己烷、异丙醇和乙醇均为色谱纯，购于国药集团化学试剂有限公司。80%磷酸、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250等，均为分析纯，购于阿拉丁公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)测定试剂盒、过氧化氢酶(catalase, CAT)测定试剂盒和丙二醛(malondialdehyde, MDA)测试盒，均购自南京建成生物工程研究所。

高效液相色谱(日本岛津，LC-10AVP)，气相色谱(中国精科捷，GC-9160)，Chiralcel OD-H柱(上海大赛璐药物手性技术有限公司)，浮游植物分类荧光仪(德国Walz，Phyto-PAM)。

1.2 ICP对映体的制备和定量

用HPLC法对ICP进行拆分与制备。色谱条件：流动相为80∶20(V∶V)的正己烷/异丙醇，大赛璐手性柱Chiralcel OD-H，流速为0.8 mL·min-1，紫外检测波长230 nm，室温，进样量为每次20 μL。在此条件下，ICP对映异构体的出峰顺序先后为(+)-ICP、(-)-ICP[2]。人工手动在检测器出口处收集液体，并在室温下旋蒸浓缩。

利用气相色谱对ICP的2个对映体样品进行定量。色谱条件：HP-5石英毛细管柱；氮载气流速为1.0 mL·min-1，进样口温度为250 ℃，升温程序为柱温箱初始温度180 ℃，保持2 min，然后20 ℃·min-1升温到280 ℃，保持10 min，NP检测器温度是300 ℃，在不分流模式下对映体样品的进样量为1 μL。

1.3 实验生物的培养及染毒

1.3.1 水华微囊藻的培养及染毒

浮游植物水华微囊藻由中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库提供。按照藻类生长抑制试验的标准方法(GB/T 31270)，采用BG11培养液培养。

当水华微囊藻进入对数生长期之后，并调节初始接种藻密度为5×106mL-1，用ICP及其对映体进行染毒。浓度设置为10-4、10-3、10-2、10-1和1 mg·L-1，并设置溶剂对照(0.03%丙酮)，每组设置4个平行。每天摇动3～4次，保持藻类悬浮生长。

1.3.2 大型蚤的培养及染毒

浮游动物大型蚤，购于中国科学院武汉水生生物研究所。大型蚤的培养液按照OECD规定[6]进行培养。大型蚤敏感性试验采用国际标准《水质-大型蚤运动抑制的测定》(ISO 6341:1996)[7]进行。

不同日龄的蚤体内抗氧化酶活性不同，本文选择4日龄的蚤染毒进行实验[8-9]，每个浓度实验蚤60只，染毒溶液2 L，每组设置3个平行。根据Lin等[2]研究中所得出的ICP及其对映体对大型蚤的48 h-LC50，按(-)-ICP LC50值的1/353～1/18的比例设置染毒溶液浓度梯度，分别为1、2.5、5、10和20 μg·L-1，并设置溶剂对照(0.03%丙酮)。染毒48 h后进行氧化损伤指标测定。

1.4 叶绿素a含量的测定

水华微囊藻染毒10 d后，取1 mL藻液置于样品杯中，在浮游植物分类荧光仪的32 μmol·(m2·s)-1光强下测定叶绿素a含量[10]。实验重复3次。

1.5 酶源的制备

对水华微囊藻染毒96 h后，每瓶取80 mL藻液，在4 ℃条件下5 000 r·min-1冷冻离心15 min，去除上清液，用磷酸缓冲液冲洗，并于冰浴中超声破碎15 min(工作3 s，间隔3 s)。

对大型蚤染毒48 h后，取50只蚤，吸干表面水分，放入离心管中，加入Tris-HCl缓冲液置于冰浴中超声破碎5 min(工作3 s，间隔3 s)。

水华微囊藻和大型蚤在破碎完全后，于4 ℃条件下12 000 r·min-1冷冻离心10 min，取上清液，即为粗酶液样品。-80 ℃超低温保存待用。

1.6 蛋白含量及氧化损伤相关指标的测定

蛋白质含量采用考马斯亮蓝比色法测定[11]；SOD、CAT活性及MDA含量均根据南京建成生物公司的试剂盒进行测定。实验均重复3次。

1.7 显著性检验

用Office excel和Origin 8.5进行数据的图表分析，用SPSS16.0软件进行相关显著性分析。

2 结果(Results)

2.1 ICP对映体的拆分

ICP液相色谱拆分条件为：流动相正己烷/异丙醇80∶20，流速0.8 mL·min-1，柱压为5.0 MPa。ICP这2个对映体的保留时间分别为8.5 min和13.2 min，达到基线分离，对映体分离色谱图如图2所示。

图2 ICP对映体手性拆分的典型图谱Fig. 2 Chiral separation chromatogram of ICP enantiomers

2.2 ICP对浮游植物水华微囊藻叶绿素a含量的对映体选择性影响

ICP及其对映体对水华微囊藻叶绿素a含量的影响如图3所示，水华微囊藻在(+)-ICP胁迫下，10-4mg·L-1浓度组的叶绿素a含量均显著高于对照组(P<0.05)，而10-2～1 mg·L-1浓度组的叶绿素a含量均显著低于对照组(P<0.05)。在(-)-ICP胁迫下，10-4～10-1mg·L-1浓度组的叶绿素a含量均显著高于对照组(P<0.05)，而1 mg·L-1的(-)-ICP的叶绿素a含量与对照组相比则无显著性差异(P>0.05)。在ICP外消旋体(rac-ICP)胁迫下，10-3～10-2mg·L-1浓度组的叶绿素a含量均显著高于对照组(P<0.05)，1 mg·L-1rac-ICP浓度组的叶绿素a含量显著低于对照组(P<0.05)。由以上结果可知，(+)-ICP和(-)-ICP对水华微囊藻叶绿素a含量影响存在对映体选择性差异。

图3 ICP及其对映体对水华微囊藻叶绿素a含量的影响注：rac-ICP表示ICP的外消旋体；相邻条上不同的小写字母表示相同 浓度不同对映体之间存在显著差异；相同填充图案上 不同的大写字母表示相同对映体不同浓度之间存在显著差异； *表示与对照组相比有显著差异；P<0.05，n=3；下同。Fig. 3 Effect of ICP and enantiomers on chlorophyll a of Microcystis flos-aquaeNote: rac-ICP stands for the racemate of ICP; different small letters above adjacent bars indicate significant differences between different enantiomers; different capital letters on the same pattern indicate significant differences between different concentrations of the same enantiomer; *indicates a significant difference compared with control; P<0.05, n=3; the same as follow.

2.3 ICP对浮游植物水华微囊藻氧化损伤的对映体选择性影响

2.3.1 ICP对水华微囊藻SOD活性的对映体选择性影响

ICP及其对映体对水华微囊藻SOD活性的影响如图4所示，水华微囊藻在(+)-ICP胁迫下，10-3～1 mg·L-1浓度组的SOD活性均显著低于对照组(P<0.05)，与对照组相比分别下降了15.4%、31.2%、25.7%和22.4%；而10-4mg·L-1浓度组的SOD活性与对照组无显著差异(P>0.05)。在(-)-ICP胁迫下，各浓度组的SOD活性与对照组均无显著性差异(P>0.05)。在rac-ICP胁迫下，其SOD活性随着rac-ICP浓度的增加呈先上升后下降的趋势，其中，低浓度组(10-4和10-3mg·L-1)的SOD的活性与对照组相比都上升了10.0%(P<0.05)；高浓度组(≥10-2mg·L-1)的SOD活性均显著小于对照组(P<0.05)，且1 mg·L-1浓度组的SOD活性与对照组相比下降了38.0%。由以上结果可知，(+)-ICP和(-)-ICP对水华微囊藻SOD活性影响存在对映体选择性差异。

图4 ICP及其对映体对水华微囊藻超氧化物 歧化酶(SOD)活性的影响Fig. 4 Effect of ICP and its enantiomers on superoxide dismutase (SOD) activity of Microcystis flos-aquae

2.3.2 ICP对水华微囊藻CAT活性的对映体选择性影响

ICP及其对映体对水华微囊藻CAT活性的影响如图5所示，在(+)-ICP胁迫下，各浓度组的CAT活性随着(+)-ICP浓度的增加而逐渐降低，且呈现剂量效应关系。10-4～10-1mg·L-1浓度组的CAT酶活性显著高于对照组(P<0.05)，与对照组相比分别上升了70.0%、40.0%、20.0%和10.0%；而1 mg·L-1浓度组的CAT活性显著低于对照组(P<0.05)。在(-)-ICP胁迫下，水华微囊藻的CAT活性变化随着(-)-ICP浓度的增加呈现先上升后下降的趋势。10-4～10-3mg·L-1浓度组的CAT活性显著高于对照组(P<0.05)；10-2～1 mg·L-1浓度组的CAT活性显著低于对照组(P<0.05)。在rac-ICP的胁迫下，除了10-3mg·L-1浓度组的CAT活性与对照组无显著性差异(P>0.05)，其余浓度组的CAT活性均显著低于对照组(P<0.05)，与对照组相比分别下降了28.8%、33.3%、25.1%和16.6%。由此可见，(+)-ICP和(-)-ICP对水华微囊藻CAT活性影响存在对映体选择性差异。

图5 ICP及其对映体对水华微囊藻 过氧化氢酶(CAT)活性的影响Fig. 5 Effect of ICP and its enantiomers on catalase (CAT) activity of Microcystis flos-aquae

2.3.3 ICP对水华微囊藻MDA含量的对映体选择性影响

ICP及其对映体对水华微囊藻MDA含量的影响如图6所示，在(+)-ICP胁迫下，除了10-3mg·L-1浓度组的MDA含量与对照组无显著差异(P>0.05)，其他浓度组的MDA含量均显著低于对照组(P<0.05)，且与对照组相比分别下降了23.0%、26.8%、26.8%和9.2%。在(-)-ICP胁迫下，除了10-3mg·L-1浓度组的MDA含量与对照组无显著差异(P>0.05)，其余浓度组的MDA含量均显著低于对照组(P<0.05)，且与对照组相比分别下降了29.0%、23.1%、16.4%和10.4%。在rac-ICP的胁迫下，各浓度组的MDA含量均显著低于对照组(P<0.05)，且与对照组相比分别下降了28.2%、13.7%、43.8%、44.1%和38.8%。由此可见，(+)-ICP和(-)-ICP对水华微囊藻MDA含量的对映体选择性影响不明显。

图6 ICP及其对映体对水华微囊藻 丙二醛(MDA)含量的影响Fig. 6 Effect of ICP and its enantiomers on malondialdehyde (MDA) content of Microcystis flos-aquae

2.4 ICP对浮游动物大型蚤氧化损伤的对映体选择性影响

2.4.1 ICP对大型蚤SOD活性的对映体选择性影响

ICP及其对映体对大型蚤体内SOD活性的影响如图7所示，在(+)-ICP胁迫下，5 μg·L-1浓度组的SOD活性与对照组相比下降了17.0%(P<0.05)；而10 μg·L-1和20 μg·L-1浓度组的SOD活性与对照组无显著差异(P>0.05)。在(-)-ICP胁迫下，各浓度组大型蚤体内的SOD活性均显著高于对照组(P<0.05)，且(-)-ICP浓度越高，SOD的活性越大；其中10 μg·L-1和20 μg·L-1浓度组的SOD活性与对照组相比分别上升了68.0%和79.0%。在rac-ICP胁迫下，5 μg·L-1浓度组的SOD活性与对照组无显著差异(P>0.05)；10 μg·L-1和20 μg·L-1浓度组的SOD活性与对照组相比分别增加了16.0%和24.0%。由此可见，(+)-ICP和(-)-ICP对大型蚤SOD活性的影响存在对映体选择性差异。

图7 不同浓度ICP及其对映体对大型 蚤体内SOD活性的影响Fig. 7 Effects of ICP and its enantiomers on SOD activity in Daphnia magna

2.4.2 ICP对大型蚤CAT活性的对映体选择性影响

ICP及其对映体对大型蚤体内CAT活性的影响如图8所示，在(+)-ICP胁迫下，除1 μg·L-1和20 μg·L-1浓度组的CAT活性与对照组相比分别下降了19.7%和15.2%，其余浓度组CAT活性均显著高于对照组(P<0.05)，且2.5 μg·L-1和5 μg·L-1浓度组的CAT活性与对照组相比分别上升了14.0%和12.0%。在(-)-ICP胁迫下，各浓度组CAT活性均显著低于对照组(P<0.05)，且活性下降范围是17.2%～40.9%。在rac-ICP胁迫下，各浓度组CAT活性均显著低于对照组(P<0.05)，且活性下降范围是5.5%～17.8%。由此可见，ICP对大型蚤CAT活性的影响存在对映体选择性差异。

图8 不同浓度ICP及其对映体对大型 蚤体内CAT活性的影响Fig. 8 Effects of ICP and its enantiomers on CAT activity in Daphnia magna

2.4.3 ICP对大型蚤MDA含量的对映体选择性影响

ICP及其对映体对大型蚤体内MDA含量的影响如图9所示，在(+)-ICP胁迫下，各浓度组的MDA含量随着(+)-ICP浓度增加而上升；除了1 μg·L-1浓度组的MDA含量显著低于对照组(P<0.05)，其余浓度组均显著高于对照组(P<0.05)，且5、10和 20 μg·L-1浓度组的MDA含量与对照组相比分别上升了23.0%、52.0%和139.0%。在(-)-ICP胁迫下，各浓度组大型蚤体内的MDA含量均显著低于对照组(P<0.05)，在1～5 μg·L-1时，大型蚤体内MDA含量随浓度增加而上升，而在5～20 μg·L-1时，MDA含量随浓度增加而下降(P<0.05)。在5 μg·L-1浓度时，虽然大型蚤体内MDA含量最高，但是与对照组相比也下降了8.0%。在rac-ICP胁迫下，1～5 μg·L-1浓度组的MDA含量与对照组无显著性差异(P>0.05)；而10 μg·L-1和20 μg·L-1浓度组的MDA含量与对照组相比分别下降了7.4%和17.5%。由此可见，ICP对大型蚤MDA含量的影响存在显著的对映体选择性差异。

图9 不同浓度ICP及其对映体对大型 蚤体内MDA含量的影响Fig. 9 Effects of ICP and its enantiomers on MDA content in Daphnia magna

3 讨论(Discussion)

叶绿素a是衡量植物生长状况的重要指标之一，其含量可以反映浮游植物的存活情况[12]。本研究发现，对于(+)-ICP，最低浓度10-4mg·L-1浓度组对叶绿素a含量均表现为促进作用，而10-2～1 mg·L-1浓度组对叶绿素a含量均表现为抑制作用；而对于(-)-ICP，除了最高浓度1 mg·L-1，其余浓度组对水华微囊藻的叶绿素a含量均表现为促进作用。这个结果说明ICP这2个对映体在一定的浓度范围对水华微囊藻的叶绿素a含量表现出“低促高抑”的现象，称为Hormesis效应[13]。低促现象的出现一方面可能是因为低浓度的ICP启动了水华微囊藻机体内修复系统功能及过量修复；而另一方面也可能是因为水华微囊藻利用了ICP中的P元素作为其营养源，提高了叶绿素a的含量，从而促进了藻类生长[14]。然而，随着ICP对映体浓度的增加，可能抑制了水华微囊藻光合色素的合成，从而对水华微囊藻产生的综合效应逐渐从促进转变为抑制。本实验结果与Lu等[15]对ICP胁迫斜生栅藻藻密度的研究结果基本一致。Smythers等[16]研究发现，小球藻暴露在除草剂拿捕净后，光合色素合成酶活性受到抑制，导致叶绿素a含量降低。此外，从水华微囊藻出现抑制作用时的ICP及其对映体浓度也可以推出它们的毒性大小顺序为：(+)-ICP>rac-ICP>(-)-ICP。这与Lin等[2]研究中ICP及其对映体对大型蚤的48 h急性毒性大小顺序一致。

同样的，浮游动物大型蚤在受到(-)-ICP和rac-ICP的轻微胁迫时，通过诱导自身的SOD酶来增强抗氧化能力。而毒性较大的(+)-ICP对大型蚤的胁迫可能已经过了SOD的诱导期，而CAT活性的增加从侧面印证了这种推测，因为前期SOD的大量消耗产生了大量的H2O2，从而诱导了CAT活性的增加[25]。Hu等[26]研究发现，氯菊酯的2个对映体1R-tris-PM和1S-cis-PM诱导了PC12细胞的CAT酶而抑制了SOD酶。另外，ICP及其对映体处理组中大型蚤MDA含量变化说明了(+)-ICP浓度的增加会对大型蚤造成更大程度的脂质过氧化作用，而相同浓度的(-)-ICP和rac-ICP处理组的MDA含量未高于空白组，结合SOD活性和CAT活性的结果，可知(-)-ICP和rac-ICP处理组并未引起大型蚤的氧化损伤，而MDA含量减少可能是因为脂质过氧化作用减弱。Li等[27]发现三氯杀虫酯中毒性更大的S-(+)-AF会导致PC12细胞中SOD活性降低，而MDA含量上升。

因此，ICP对浮游生物的氧化损伤存在对映体选择性差异，且对于浮游植物和浮游动物，毒性顺序都表现为(+)-ICP>(-)-ICP。除了浮游植物和浮游动物，Di等[28]研究发现，对于4种陆生生物ICP的2个对映体的毒性指向性与本文一致，且(+)-ICP和(-)-ICP的毒性相差232倍。除了ICP之外，很多文献也都发现其他手性化合物会引起氧化损伤的对映体选择性差异。Hu等[26]研究发现，氯菊酯胁迫下，1R-cis-PM和1S-cis-PM诱导了PC12细胞的CAT活性上升而使SOD活性显著下降。Li等[27]发现三氯杀虫酯的S-(+)-AF使得PC12细胞的SOD和CAT活性降低，MDA水平升高。Huang等[29]研究发现，(+)-已唑醇对斜生栅藻SOD活性产生的胁迫压力大于(-)-已唑醇；而在诱导CAT酶活性上，(-)-已唑醇大于(+)-已唑醇。

综上所述，手性农药在使用过程中，除了高效对映体对靶标生物有明显作用之外，其他无效或低效的对映体也会对非靶标生物造成不同程度的伤害。而本文研究的ICP对映体通过液相色谱进行拆分，对于水华微囊藻的叶绿素a、水华微囊藻和大型蚤的氧化损伤指标SOD活性、CAT活性和MDA含量毒性影响大小均为(+)-ICP>(-)-ICP，且在ICP浓度≥10-4mg·L-1时，对水华微囊藻的叶绿素a和氧化损伤就有明显的对映体选择性差异；在ICP浓度≥1 μg·L-1时，对大型蚤的氧化损伤就有明显的对映体选择性差异。此项研究结果为手性农药的环境生态风险评价提供科学依据。