红鳍东方鲀的MAPK信号通路分析

2021-09-22 02:03王冠胡子文周金旭王盛南李鑫仇雪梅王秀利
河北渔业 2021年9期

王冠 胡子文 周金旭 王盛南 李鑫 仇雪梅 王秀利

摘 要:为研究红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)不同生长阶段生长发育差异的分子机制,基于13与15月龄红鳍东方鲀的脑与肌肉组织转录组数据,以及在两时期间KEGG通路分析中差异显著的MAPK信号通路,结合基因互作分析对这期间发生的生物过程进行生物信息学方面的关联预测。结果表明:MAPK信号通路通过调节fos和jun及其下游基因,促进这期间肌肉和骨骼发育,使红鳍东方鲀在两时期间生长。而fos和jun在两组织均上调,但在脑中抑制fos和jun的基因上调程度更高,而在肌肉中则较低。MAPK信号通路介导的egr1、c/ebpβ、ctgf等基因与骨骼发育相关,在此期间可能伴随着红鳍东方鲀骨骼的生长。MAPK信号通路还调节tgf-β、ctgf、pai1等与组织纤维化相关的基因,在转录层面上纤维化过程在肌肉中持续而在脑中减弱,可能促进了肌肉与骨骼的发育。MAPK信号通路还可能影响脂质代谢,即脑中γ-氨基丁酸相关基因下调有促进脂肪积累的作用,该过程伴随着基础代谢降低。肌肉中核受体亚家族D组(nr1d)基因的下调促进了脂质吸收,mstn b基因可能调节了这个过程。

关键词:红鳍东方鲀(Takifugu rubripes);组织差异基因;MAPK信号通路;生物信息分析

红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)是国内北方重要的海水养殖鱼类,是出口创汇的主要海珍品[1]。但由于在北方养殖的红鳍东方鲀商品鱼不能当年育成[2],养殖需经历三个阶段,幼鱼鱼苗在5—6月份至10—11月份时期;11月份至翌年4月份时期;翌年4月份至10—11月份的养成期。而在养成期的4—6月,虽水温回升,鱼体活跃,但生长依然缓慢。由于红鳍东方鲀在脊椎动物中基因组较小,较易于分析其基因间的关系,因此红鳍东方鲀为脊椎动物模式物种之一[3]。因而研究红鳍东方鲀在缓慢生长时期的分子变化,不仅可以了解到这一时期的生命活动,探求缩短缓慢生长时期,节约养殖成本增加收益的方法,同时可以为应用于其它物种提供一定的参考。

脑部存在大量神经网络,可控制垂体等内分泌器官调节激素分泌,进而影响个体的生长代谢。而肌肉则是可以直接反映生长性状的组织,有多数生长相关激素受体存在。因此通过比较研究这两个与生长性状密切相关组织的基因表达差异及对应的信号通路之间的关联,有助于了解影响生长性状的生理过程及其涉及到的生化反应。

信号通路是指能将细胞外的分子信号经细胞膜传入细胞内发挥效应的一系列酶促反应通路。这些细胞外的分子信号(即配体)可与位于细胞表面或细胞内部的受体结合,引起受体的构象变化,从而实现信号的进一步传递。每个细胞对特定的细胞外信号分子做出不同反应,使它们得以共同完成生命活动。而丝裂原活化蛋白激酶(MAPK,Mitogen-activated protein kinase)信号通路,是一种重要的信号通路,可由多种信号激活酪氨酸激酶受体,在激酶级联反应后引发转录和翻译,进而发生细胞增殖、分化和迁移。因此在MAPK信号通路上脑与肌肉两组织的差异可反应这期间发生的生命活动。

本研究基于脑、肌肉转录组的差异基因通过MAPK信号通路以及差异基因互作,分析红鳍东方鲀在缓慢生长的期间两个组织在关键的表达及信号通路上的差异,以期发现这个过程中影响红鳍东方鲀生长的分子变化及生物过程,为红鳍东方鲀发育过程及生产实践应用提供基础数据。

1 材料及方法

1.1 数据获取

本研究是基于本实验室的红鳍东方鲀脑和肌肉的转录组数据[4]进行的后续分析。转录组数据来自健康的(13月龄与15月龄)实验鱼的脑与肌肉组织,并使用RNA-Seq基因组比对软件HISAT2 v2.0.5将过滤后的序列读长(reads)与红鳍东方鲀参照基因组(FUGU 5)进行比对(mapping)后使用StringTie v1.3.3b软件进行组装。并以|log2(FoldChange)| > 1 &padj< 0.05为标准筛选差异基因,log2(FoldChange)>1为上调,反之为下调。通过超几何分布原理进行富集分析,在富集分析中发现KEGG(京都基因与基因组百科全书,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路中MAPK信號通路具有显著性(padj<0.05),且与生长相关,富集分析图见王盛南等[4]。因而本文基于该通路对红鳍东方鲀该阶段生长的生物学过程进行预测。

1.2 性状测量

分别测量13月龄与15月龄红鳍东方鲀各30尾样品的体重、体长和体全长,使用SPSS19进行单因素方差分析,分析这两时期这些性状的差异性。

1.3 差异基因筛选

在前期工作的基础上[4],将差异基因进一步汇总分析。比较两组织之间随时间变化的差异基因。可找到包括只在脑或肌肉表达的差异基因,两组织中随时间表达趋势相同的差异基因,以及两组织随时间表达趋势相反的差异基因等几类,这些差异基因的筛选有助于判断脑与肌肉这两组织中,代谢过程中的相同及差异。

1.4 差异基因互作分析

以上述两组织之间随时间变化的差异基因为分析对象,使用STRING 11.0(https://string-db.org/)在线分析基因产物之间的互作,构建蛋白质关联网络,设置最低互作置信值为 0.400,并使用k-means聚类的方法对差异基因对应的蛋白产物进行蛋白质关联性分析。

2 结果与分析

2.1 两时期性状分析

性状测量结果显示,13月龄红鳍东方鲀平均体重(0.46±0.07)kg,平均体长为(23.68±1.27)cm,平均体全长为(28.37±1.55)cm;而15月龄平均体重(0.53±0.07)kg,平均体长为(25.33±1.00)cm,平均体全长为(29.98±1.24)cm。这些性状15月龄较13月龄差异均极显著,P<0.01。体重、体长和体全长分别平均增长14.93%、6.97%及5.70%。

2.2 MAPK信号通路

KEGG通路分析中,15月龄相对13月龄的脑组织MAPK信号通路是与生长相关的显著性最高的信号通路,通路图如图1A(封二)所示,富集到的差异基因也是具显著性的通路中最多的,有24个差异基因[4]。其中上调基因有20个,因而脑组织MAPK信号通路显著性主要是由上调基因引起,而下调的基因很少,只有4个。且由通路图可知,与增殖分化相关的基因上调且包括nr4a1(对应图1A中Nur77,产物为神经生长因子IB,NGFIB)以及属于激活蛋白1(Activator protein 1,AP-1)家族的fos(封二图1A中c-fos)、jun(封二图1A中c-JUN)及jund。而抑制fos上游基因ERK(细胞外调节蛋白激酶)的MKP(MAPK磷酸酶,又称DUSP)的基因也上调,且上调程度较fos更高,对应的差异基因包括dusp1、dusp2、dusp6,这些基因全部是上调基因。而dusp2的产物也有抑制JNK(c-Jun N-末端激酶)的功能。JNK的基因作为jun与jund的上游基因也被上调程度更大的HSP72(热激蛋白72)相关基因抑制。

而在15月龄相对13月龄的肌肉组织中MAPK通路见图1B(封二),有15个差异基因,因其差异基因占该通路表达的基因较少,使得该通路差异不显著。在差异基因中上调基因有12个,下调基因只有3个。而fos、jun及jund这三个与增殖分化相关的基因也在肌肉中上调,相较于脑中不同的是,在上游抑制它们的图1B(封二)中MKP与HSP72中的基因上调程度较小,上调的基因也少,并且图1B(封二)中MKP的dusp10随时间下调,这些因素可能是肌肉中fos上调程度较大的原因。而红鳍东方鲀在两时期间体重、体长和体全长性状显著增加,这些性状的改变伴随着肌肉量的增加。因而,有增殖分化相关作用的fos、jun等上调基因,可能是这两时期间影响肌肉组织生长,进而引起这期间的性状差异的重要基因。

2.3 两组织间的关键差异基因分析

研究结果发现两组织间只在脑组织表达的差异基因有86个,其中有75个随时间下调,其余随时间上调。在两月龄时期间相较于脑,仅在肌肉中有差异表达的基因则只有3个,其中有1个随时间上调,为组蛋白甲基转移酶1(SET and MYND domain containing 1,smyd1),研究发现该基因有心肌和骨骼肌的组织特异性[5],在对小鼠[6]和斑马鱼[7]的研究中发现,smyd1是调节心肌和骨骼肌发育的关键因子,但未发现其对应的KEGG通路;另2个下调,其中一个是新发现的基因,该基因没有与现有数据库匹配的注释,其功能未知,另一个为蛋白磷酸酶1调节亚基3A(Protein phosphatase 1 regulatory subunit 3A,ppp1r3a)。随时间变化,在两组织同时上调表达的差异基因有22个基因,而同时下调基因有4个。此外,还有3个基因在脑中下调,而在肌肉中上调,分别是肌生長抑制素b(Myostatin b,mstnb)、radical S-adenosyl methionine domain containing 2(rsad2)和甘油3-磷酸脱氢酶(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1,gpd1)。

2.4 差异基因互作分析结果

针对上述脑、肌肉两组织在两时期不同关联的基因,可找到包括在脑中随时间下调而在肌肉中不表达的基因,脑中随时间上调而在肌肉中不表达的基因,肌肉组织中有差异而在脑中不表达的基因,两组织中随时间表达趋势相同的差异基因,以及两组织随时间表达趋势相反的差异基因,将这五类进行互作分析及聚类。我们发现两时期在脑组织下调表达而在肌肉中不表达差异基因有60个,并出现了两个与功能相关的聚类,见图2(封三),分别与光转导(图中示蓝色)和γ-氨基丁酸相关(图中示绿色),见图2(封三);而在两组织中随时间表达趋势相同的差异基因有23个被识别,是与AP-1相关的一个聚类,见图3(封三),而其他的分类中没有发现基因产物间的互作。

3 讨论

3.1 MAPK信号通路在两组织之间的差异

基于脑与肌肉两组织MAPK信号通路图中可以发现,与增殖分化相关的基因包括fos、jun及jund在两组织均上调表达,而肌肉中有抑制这些基因功能的MKP与HSP72的相关基因上调程度较小,对应差异基因也少。其中MKP对MAPK起负调控作用[8],而肌肉中dusp10随时间下调,降低了对ERK及JNK的抑制,可促进fos、jun的表达。而HSP72作为一种热激蛋白,可以促进DNA修复,并在细胞凋亡、生长和分化过程中发挥功能[9]。

通路中两组织差异最大的是gadd45,有4个属于该类的基因在脑中上调表达,而在肌肉中则并无显著性。而gadd45功能与生长停滞和刺激DNA修复有关[10],并可能是脑中taok3基因(TAO基因集内)下调表达的原因(封二图1A),TAOK3是一种MAPKKK(丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶又称MAP3K),被证明是成骨细胞JNK途径上游的激活剂,有关人和小鼠的实验证明,taok3缺乏使JNK途径的活化有缺陷,并伴随骨质减少[11]。 此外,图1a中Nur77对应基因也在脑中上调,其可被生理和物理刺激来诱导[12],在小鼠T细胞的研究中发现,Nur77可以抑制AP-1功能进而抑制其下游基因的表达[13]。脑中GF(生长因子)基因集上调表达,上调基因为血管生成素-2a(angpt2a)。而RTK(受体酪氨酸激酶)中的基因LOC101073085、LOC101064806在脑中上调,原肌球蛋白受体激酶B(ntrk2b)下调。蛋白磷酸酶1(ppm1)属于PP2CA(封二图1A),在脑中下调,有负调节MAPKK(丝裂原活化蛋白激酶激酶又称MAP2K)的活性并抑制JNK激酶级联反应的激活的作用。

而在肌肉中上调表达且差异倍数较大而脑中无差异的基因有crkl、mknk2b、rps6ka5及myca。其中crkl(封二图1B中crkⅡ)已被证明可以激活RAS和JUN激酶信号通路并以RAS依赖性方式转化成纤维细胞[14]。而mknk2b和rps6ka5的产物属于图1B(封二)中MSK1/2,前者被显示与ERK有相互作用[15],后者与立即早期基因(ieg)表达相关[16]。myca在肌肉中随时间也上调表达,有驱动细胞增殖的能力[17]。而肌肉中下调且在脑中无差异的基因是转化生长因子β3(tgfb3)(封二图1B中TGFB),可参与调节细胞黏附和细胞外基质(ECM)形成的分子[18]。

综上可知,两个时期间脑组织肌肉组织在MAPK通路发生着不同的生命过程。两组织该通路差异基因虽大多与AP-1家族的fos和jun基因相关,且两种基因在两组织中随时间都上调表达,但脑中很多上调的基因都抑制ERK与JNK,进而抑制fos和jun的表达;而肌肉中则有抑制这两基因的基因下调,而促进的上调的趋势,促进fos和jun的表达。并且肌肉组织中促进肌肉增殖分化的基因上调。

3.2 MAPK信号通路影响骨骼发育

由上述两组织MAPK信号通路分析可知,两种组织间对AP-1家族的fos和jun基因影响不同,在脑中抑制而在肌肉中促进。同时从两组织同步变化的差异基因的基因产物关联分析图(封三图3)可知,其中AP-1家族的fos在关联性分析预测中与聚为一类的其余11个基因产物均相关。因此这些关联的基因产物可能发挥了肌肉MAPK中促进fos和jun表达要引起的作用。

AP-1是转录因子家族,将细胞外信号转换成特定靶基因表达的变化,这些靶基因在其启动子或增强子区域带有一个AP-1结合位点,活性可通过与其他转录调节因子的相互作用进行调节[19]。而AP-1转录因子包括FOS家族(FOS、FOSB、FRA-1和FRA-2)与JUN家族(JUN、JUNB和JUND),它们可形成异源二聚体[20]。一些研究发现AP-1家族部分基因与骨骼发育相关。小鼠发育过程中FOS表达对软骨内骨化过程起关键作用[21],并且敲除后其骨骼发育及造血会有严重缺陷[22]。而缺少fra-1的小鼠会发展成一种骨量减少的低骨量疾病[23],缺少junb的小鼠由于细胞自主的成骨细胞和破骨细胞缺陷而具有骨质疏松[24]。除此之外,AP-1家族基因可能与纤维细胞的生长有关。C-JUN已被证明是成纤维细胞增殖所必需的,缺乏C-JUN的小鼠成纤维细胞在紫外线照射后会经历延长的细胞周期停滞[25]。可能由于这些基因,使MAPK通路成为控制成骨细胞分化进而骨骼矿化的分子通路之一[11]。

Aceto等[26]使用全组织转录组研究改变的重力和药物治疗对斑马鱼幼鱼的影响,发现fos、fosb、egr1(对应封三图3 ENSTRUG00000008379)、socs3a(对应图3 socs3)、gadd45b、klf2a隨骨骼增加而增加,而这些基因除gadd45b(见封三图1A)只在脑中随时间上调表达外,其他均出现在图3,而这些基因被证明与骨骼发育相关。其中小鼠klf2基因的缺失会导致血管、骨骼和颅面发育的缺陷,并参与骨发育[27]。而在小鼠骨髓细胞研究发现细胞因子信号传导抑制因子3(socs3)的反义敲降强烈抑制破骨细胞的形成[28]。egr1属于由生长因子迅速诱导的早期基因类别,在成骨细胞中被诱导[29],在斑马鱼中,egr1被证明是由表皮生长因子(FGF)诱导的调控软骨发育的调控级联的一部分[30]。而在大鼠中发现EGR1可被MAPK通路中的ERK和JNK通路介导[31],而在人类发现ERK可诱导c/ebpβ(CCAAT/增强子结合蛋白)(封三图3, ENSTRUG00000007449),而c/EBPβ是EGR1的伴侣蛋白,相互作用后形成的激活复合物导致ldlr(低密度脂蛋白受体)基因转录迅速增加[32],而LDLR家族蛋白[33]在鼠骨髓基质细胞上被证明可能与CTGF结合[34],此外鼠骨髓基质细胞上的研究还发现CTGF与LDLR家族蛋白结合后可能被迅速内化并降解[34],而在本研究所用转录组数据中ldlr在两时期间不具显著性,肌肉中表达量几乎不变,而脑中表达量增加与c/ebpβ和egr1表达趋势一致。而CTGF则影响软骨发育,敲除ctgf的小鼠在出生时会由于严重的软骨发育不良而因呼吸压力而死亡[35],在非洲爪蟾上的实验发现CTGF可与BMP4(骨形态发生蛋白4)结合并对其进行抑制调节[36]。本研究转录组中bmp4在两时期中脑组织表达均显著高于肌肉组织,而同组织不同时期无显著差异。此外基于KEGG的TGF-β信号通路(KEGG ID为tru04350)发现,BMP与其受体结合后可磷酸化SMAD1,SMAD1受到SMAD6/7抑制,而SMAD1和SMAD4可促进ID4(DNA结合蛋白抑制剂ID-4)表达,而ID4可能调节一些基因使成骨细胞分化。在本研究转录组中在脑中smad1/4表达量低,smad6/7上调表达,id4在下调表达。而在肌肉中smad1/4上调表达而smad6/7表达量低,id4表达量较高。id4在这两时期间由脑表达量显著高于肌肉,转变为肌肉表达量显著高于脑。上述基因间的互作见图4。

故此,MAPK信号通路及其下游的egr1、c/ebpβ、ctgf、id4等一系列基因调节骨骼的发育。CTGF虽抑制BMP4,但在骨骼发育中不可或缺。而BMP下游基因在两组织变化的趋势与MAPK信号通路中两组织抑制ERK与JNK的基因的趋势一致,脑中抑制ERK与JNK的基因上调,对应抑制BMP下游过程的基因也上调,肌肉中与之相反。egr1、c/ebpβ、ctgf等基因在这两时期大量且广泛地表达,这些基因可能影响在这期间红鳍东方鲀骨骼的发育,使得体长具有显著性。

3.3 MAPK信号通路影响组织纤维化

CTGF除与骨骼发育相关外,可以介导转化生长因子β(TGF-β)诱导ECM的产生来促进纤维化[18,36],TGF-β还受KLF4(封三图3)的调节[37]。而在本研究中TGF-β3(封三图1B中TGFB)在肌肉中随时间下调,在肌肉组织13月龄表达量显著高于脑组织,而在脑中两时期差异不显著。而在本研究转录组中差异表达的ECM包括胶原蛋白IV(col4)和肌腱蛋白C(tenascin c,tn-c),有研究发现在ctgf缺陷型小鼠的胶原蛋白IV表达会减少且不连续,而造成血管生成的严重缺陷,因而胶原蛋白IV受TGF-β调节且影响血管生成[38]。

此外TGF-β调控的基因还有SOCS3[35]、HES家族基本螺旋-环-螺旋(BHLH)[39]以及纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)[40]。BHLH在本研究中两時期脑、肌肉转录组中均下调(封三图3,bhlhe41),其旁系同源BHLHE40被证实抑制myod(肌分化因子)启动子介导的反式激活,对肌肉生长具有抑制作用[41],本研究中myod只在肌肉中表达,且两时期表达量相近,肌肉中bhlhe41下调引起的对myod表达抑制的减弱不明显,可能受到其他因子的调节。此外PAI-1(图3中serpine1)是ECM降解酶的抑制剂[40],并发现MAPK通路中的ERK对PAI-1的生成[42]至关重要。而TGF-β可磷酸化激活SMAD3,并被SMAD6/7抑制,SMAD3可与SMAD4结合[43]。影响纤维化的基因产物间相互关系见图4。

故此,MAPK信号通路还调节tgf-β、ctgf、pai1等诱导或维持ECM的基因,与组织纤维化相关,在转录层面上纤维化过程在肌肉中持续而在脑中减弱,可能促进了肌肉与骨骼的发育,进而使得体长等性状显著增加。

3.4 MAPK信号通路影响脂类代谢

此外在MAPK信号通路中脑上调表达的angptl2、socs3及fos和脑中下调表达的原肌球蛋白受体激酶B基因(trkb)可能影响着脂肪的代谢,在啮齿动物中已知(Socs3、Angptl4、Fos等基因)与能量稳态和脂肪细胞生物学中发挥作用[44]。此外,在小鼠和人类中发现BDNF(脑源性神经营养因子)和TRKB的遗传破坏会导致食欲亢进和严重肥胖[44]。而BDNF通过与TRKB结合可抑制γ-氨基丁酸(GABA)传导活性。而GABA是中枢神经系统中主要的抑制性神经递质。其相关基因在脑组织特异且随时间下调,在肌肉中不表达,见图2(封三)绿色聚类。GABA是通过谷氨酸脱羧酶(GAD,封三图2 gad1/2)的作用从谷氨酸氨基酸合成的[45],离子型受体GABAAR(封三图2 gabra1和gabrg2)是GABA的受体。而GABA转运蛋白1(GAT1,图2 slc6a1)可从突触间隙中去除GABA[46]。此外在人类肌肉中发现GABA受体的表达与静息能量消耗增加有关[47]。而在不同生长速度的幼猪肌肉转录组发现,发现基础能量消耗越大,GABA相关基因可能表达越高,其组织脂肪积累的潜力就越弱[48],故此脑中MAPK信号通路中angptl2、socs3及fos的上调及trkb和GABA相关基因的下调反映了脑中基础能量消耗减弱的脂肪积累增加。

而在本研究转录组数据发现,肌肉中显著下调的核受体亚家族D组(nr1d)基因也与脂类代谢相关,其下调促进了参与脂质吸收的基因的表达[49],因而肌肉脂质的含量可能因此降低。而另有研究发现缺乏mstnb的斑马鱼能量代谢从蛋白质依赖性转变为脂质依赖性[50],而本研究中mstnb在脑中下调表达而在肌肉中上调,因此可能在脑中脂类增加而肌肉中脂类减少,这个推测与其他上述其他基因一致,并且mstnb可能是调节这两个组织使脂肪代谢不同的原因。

故此两组织中在两月间的脂质代谢有很大不同,脑中脂类可能增加而肌肉中脂类减少,这可能由于脑部基础代谢降低,而肌肉增高。而脂质代谢可能受MAPK通路影响,而mstnb可能调节两个组织脂肪代谢,而trkb、GABA相关基因的下调有促进脂肪积累的作用,而核受体亚家族D组基因的下调促进了脂质吸收。

4 结论

本研究中,基于13与15月龄红鳍东方鲀的脑与肌肉组织MAPK信号通路,发现在通路中有增殖分化相关作用的上调基因fos和jun在脑组织中被抑制调节,而在肌肉中则促进它们的表达。此外,fos和jun的下游基因egr1、c/ebpβ、ctgf等上调且与骨骼发育相关。而MAPK信号通路还调节促进了肌肉的组织纤维化相关的基因,而在脑中这个过程减弱。此外,MAPK信号通路还可能影响脂质代谢,在脑中脂肪积累被促进并伴随着基础代谢降低,而肌肉中促进了脂质吸收。因而MAPK信号通路通过调节fos和jun及其下游基因,促进这期间肌肉和骨骼发育,使得红鳍东方鲀在两时期间体重、体长和体全长性状显著增加。

参考文献:

[1] 马爱军,李伟业,王新安,等.红鳍东方鲀养殖技术研究现状及展望[J].海洋科学,2014,38(2):116-121.

[2] 庞景贵,阎俊礼.红鳍东方鲀养成技术要点[J].河北渔业,2003(3):15-16.

[3] BRENNER S,ELGAR G,SANFORD R,et al.Characterization of the pufferfish(Fugu) genome as a compact model vertebrate genome[J].Nature,1993,366(6452):265-268.

[4] 王盛南,胡子文,余云登,等.红鳍东方鲀不同生长时期脑和肌肉的转录组比较分析[J/OL].基因组学与应用生物学:1-7[2020-10-17].http://kns.cnki.net/kcms/detail/45.1369.Q.20200428.1709.008.html.

[5] 張方亮,宾石玉,林勇,等.Smyd1蛋白的研究进展[J].生物技术通讯,2016,27(5):728-731

[6] PHAN,D,RASMUSSEN T,NAKAGAWA O,et al.BOP,a regulator of right ventricular heart development,is a direct transcriptional target of MEF2C in the developing heart[J].Development,2005,132(11):2669.

[7] TAN X G,ROTLLANT J,LI H Q,et a1.SmyD1,a histone methyhransferase,is required for myofibril organization and muscle contraction in zebrafish embryos[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(8):2713-2718.

[8] CHANG L F,KARIN M.Mammalian MAP kinase signalling cascades[J].Nature,2001,410(6824):37-40.

[9] MAYER M P,BUKAU B.Hsp70 chaperones:cellular functions and molecular mechanism[J].Cellular and molecular life sciences,2005,62(6):670.

[10] SALVADOR J M,BROWN-CLAY J D,FORNACE A J.Gadd45 in stress signaling,cell cycle control,and apoptosis[J].Adv Exp Med Biol,2013,793:1-19.

[11] LI Z,OH H,CUNG M,et al.TAOK3 is a MAP3K contributing to osteoblast differentiation and skeletal mineralization[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2020,531(4):497-502.

[12] MAXWELL M A,MUSCAT G E.The NR4A subgroup:immediate early response genes with pleiotropic physiological roles[J].Nuclear receptor signaling,2006,4(1):nrs.04002.

[13] LIU X D,WANG Y,LU H,et al.Genome-wide analysis identifies NR4A1 as a key mediator of T cell dysfunction[J].Nature,2019,567(7749):525-529.

[14] SENECHAL K,HALPERN J,SAWYERS C L.The CRKL adaptor protein transforms fibroblasts and functions in transformation by the BCR-ABL oncogene[J].Journal of Biological Chemistry,1996,271(38):23255-23261.

[15] SCHEPER G C,PARRA J L,WILSON M,et al.The N and C termini of the splice variants of the human mitogen-activated protein kinase-interacting kinase Mnk2 determine activity and localization[J].Molecular and cellular biology,2003,23(16):5692-5705.

[16] SOLOAGA A,THOMSON S,WIGGIN G R,et al.MSK2 and MSK1 mediate the mitogen variants of the human mitogen-activated protein kinase-interac[J].The EMBO journal,2003,22(11):2788-2797.

[17] LIU Y C,LI F,HANDLER J,et al.Global regulation of nucleotide biosynthetic genes by c-Myc[J].PloS one,2008,3(7):e2722.

[18] TAYA Y ,O'KANE S ,FERGUSON M W,et al.Pathogenesis of cleft palate in TGF-β3 knockout mice[J].Development,1999,126(17):3869-3879.

[19] EFERL R,WAGNER EF.AP-1:a double-edged sword in tumorigenesis[J].Nature Reviews Cancer,2003,3(11):859-868.

[20] WAGNER E F ,EFERL R.Fos/AP-1 proteins in bone and the immune system[J].Immunological Reviews,2010,208(1):126-140.

[21] RTHER U,GARBER C ,KOMITOWSKI D ,et al.Deregulated c-fos expression interferes with normal bone development in transgenic mice[J].Nature,1987,325(6103):412-416.

[22] WANG Z Q ,OVITT C,GRIGORIADIS A E,et al.Bone and haematopoietic defects in mice lacking c-fos[J].Nature,1992,360(6406):741-745.

[23] EFERL R ,HOEBERTZ A ,SCHILLING A F,et al.The Fos-related antigen Fra-1 is an activator of bone matrix formation[J].Embo Journal,2014,23(14):2789-2799.

[24] KENNER L,HOEBERTZ A,BEIL F T,.et al.Mice lacking JunB are osteopenic due to cell-autonomous osteoblast and osteoclast defects[J].Journal of Cell Biology,2004,164(4):613-623.

[25] SHAULIAN E ,KARIN M .AP-1 in cell proliferation and survival[J].Oncogene,2001,20(19):2390-2400.

[26] ACETO J, NOURIZADEH-LILLABADI R, MARE R,et al.Zebrafish bone and general physiology are differently affected by hormones or changes in gravity[J].PLoS ONE,2015,10(6): e0126928.

[27] RENN J ,PRUVOT B ,MULLER M.Detection of nitric oxide by diaminofluorescein visualizes the skeleton in living zebrafish[J].Journal of Applied Ichthyology,2014,30(4):701f App

[28] FOX S W,HAQUE S J,LOVIBOND A C,et al.The possible role of TGF-β-Induced suppressors of cytokine signaling expression in osteoclast/macrophage lineage commitment in vitro[J].The Journal of Immunology,2003,170(7):3679-3687.

[29] GRANET C ,BOUTAHAR N ,VICO L ,et al.MAPK and SRC-Kinases control EGR-1 and NF-κB inductions by changes in mechanical environment in osteoblasts[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,284(3):622-631.

[30] DALCQ J, PASQUE V, GHAYE A,et al.RUNX3,Egr1 and SOX9B form a regulatory cascade required to modulate BMP-signaling during cranial cartilage development in zebrafish[J].Plos One,2012,7(11):e50140.

[31] HWANG A R, NAM J O, KANG Y J.Fluvastatin inhibits advanced glycation end products-induced proliferation,migration,and extracellular matrix accumulation in vascular smooth muscle cells by targeting connective tissue growth factor[J].The Korean Journal of Physiology & Pharmacology,2018,22(2):193-201.

[32] ZHANG F,LIN M,ABIDI P,et al.Specific interaction of Egr1 and c/EBPβ leads to the transcriptional activation of the human low density lipoprotein receptor gene[J].Journal of Biological Chemistry,2003,278(45):44246-44254.

[33] GLIEMANN J.Receptors of the low density lipoprotein(LDL) receptor family in man.Multiple functions of the large family members via interaction with complex ligands[J].Biological Chemistry,1998,379(8-9):951.

[34] SEGARINI P R ,NESBITT J E ,LI D ,et al.The low density lipoprotein receptor-related protein/α2-macroglobulin receptor is a receptor for connective tissue growth factor[J].Journal of Biological Chemistry,2001,276(44):40659.

[35] IVKOVIC S, YOON B S, POPOFF S N,et al.Connective tissue growth factor coordinates chondrogenesis and angiogenesis during skeletal development[J].Development,2003,130(12):2779-2791.

[36] ABREU J G,KETPURA N I,REVERSADE B,et al.Connective-tissue growth factor(CTGF) modulates cell signalling by BMP and TGF-β[J].Nature cell biology,2002,4(8):599-604.

[37] LI H X,HAN M,BERNIER M,et al.Krüppel-like factor 4 promotes differentiation by transforming growth factor-β receptor-mediated smad and p38 MAPK signaling in vascular smooth muscle cells[J].Journal of Biological Chemistry,2010, 285(23):17846-17856.

[38] HALL-GLENN F, DE YOUNG R A, HUANG B L,et al.CCN2/connective tissue growth factor is essential for pericyte adhesion and endothelial basement membrane formation during angiogenesist[J].PloS one,2012,7(2):e30562.

[39] KENNARD S, LIU H, LILLY B.Transforming growth factor-β (TGF-β1) down-regulates Notch3 in fibroblasts to promote smooth muscle gene expression[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(3): 1324-1333.

[40] LI Z Z,HONG Z,PENG Z Q,et al.Acetylshikonin from Zicao ameliorates renal dysfunction and fibrosis in diabetic mice by inhibiting TGF-β1/Smad pathway[J].Human Cell,2018,31:199-209

[41] HSIAO S P,HUANG K M,CHANG H Y,et al.P/CAF rescues the Bhlhe40-mediated repression of MyoD transactivation[J].Biochemical Journal,2009,422(2):343.

[42] SAMARAKOON R ,HIGGINS C E ,HIGGINS S P ,et al.Differential requirement for MEK/ERK and SMAD signaling in PAI-1 and CTGF expression in response to microtubule disruption[J].Cellular Signalling,2009,21(6):986-995.

[43] POHLERS D,BRENMOEHL J,LFFLER I,et al.TGF-β and fibrosis in different organs—molecular pathway imprints[J].Biochimica et Biophysica Acta,2009,1792(8):746-756.

[44] BOCHUKOVA E G,LAWLER K,CROIZIER S,et al.A transcriptomic signature of the hypothalamic response to fasting and BDNF deficiency in Prader-Willi syndrome[J].Cell reports,2018,22(13):3401-3408.

[45] ROBERTS A W ,ROBB L ,RAKAR S ,et al.Placental defects and embryonic lethality in mice lacking suppressor of cytokine signaling 3[J].Proc Natl Acad,U S A,2001,98(16):9324-9329.

[46] HIRUNSATIT R,GEORGE E D,LIPSKA B K,et al.Twenty-one-base-pair insertion polymorphism creates an enhancer element and potentiates SLC6A1 GABA transporter promoter activity[J].Pharmacogenetics and genomics,2009,19(1):53.

[47] WU X X,PATKI A ,LARA-CASTRO C ,et al.Genes and biochemical pathways in human skeletal muscle affecting resting energy expenditure and fuel partitioning[J].Journal of Applied Physiology,2011,110(3):746.

[48] AYUSO M ,ALMUDENA F,YOLANDA N,et al.Developmental stage,muscle and genetic type modify muscle transcriptome in pigs:effects on gene expression and regulatory factors involved in growth and metabolism[J].Plos One,2016,11(12):e0167858.

[49] RAMAKRISHNAN S N,LAU P,BURKE L J,et al.Rev-erbβ regulates the expression of genes involved in lipid absorption in skeletal muscle cells: evidence for cross-talk between orphan nuclear receptors and myokines[J].Journal of Biological Chemistry,2005,280(10):8651-8659.

[50] GAO Y P,DAI Z R,SHI C,et al.Depletion of myostatin b promotes somatic growth and lipid metabolism in zebrafish[J].Frontiers in endocrinology,2016(7):88.

Abstract:In order to investigate the molecular mechanisms underlying the differences in growth between the different growth stages of Takifugu rubripes,this study combined gene interaction analysis with transcriptomic data from brain and muscle tissues of 13- and 15-month-old T.rubripes and MAPK signaling pathways that differed significantly in the KEGG pathway analysis between the two stages to predict the biological processes that occurred during these periods. And bioinformatic correlation prediction was performed.The results showed that MAPK signaling pathway promoted muscle and bone development during these periods by regulating fos and jun and their downstream genes,which led to the growth of T.rubripes during the two-stage period.While fos and jun were upregulated in both tissues,the genes that repress fos and jun were more upregulated in the brain and less in the muscle. MAPK signaling pathway-mediated genes such as egr1,c/ebpβ,and ctgf were found to be associated with skeletal development,and may accompany skeletal growth of T.rubripes during these periods.MAPK signaling pathway also regulates tgf-β,ctgf,pai1 and other genes associated with tissue fibrosis,and at the transcriptional level the fibrosis process persists in muscle and is diminished in brain,possibly promote the development of muscle and bone,and sort out its possible intergenic interaction process.MAPK signaling pathway may also affect lipid metabolism,while downregulation of γ-aminobutyric acid-related genes in brain has a role in promoting lipid accumulation,a process that may be accompanied by a decrease in basal metabolism, while downregulation of nuclear receptor subfamily D(nr1d) genes in muscle promotes lipid uptake, and mstn b genes may regulated this process.

Key words:Takifugu rubripes; tissue differential genes; MAPK signaling pathway; bioinformatic analysis

(收稿日期:2021-07-08)