高效液相色谱柱后衍生法测定大黄䗪虫丸中的黄曲霉毒素

2021-09-24 08:19贺敏才卢向红袁邦群
食品安全导刊 2021年25期
关键词:黄曲霉药典毒素

贺敏才,卢向红,袁邦群

(娄底市食品药品检验检测所,湖南娄底 417000)

黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株产生的一类致癌物质,可诱发肝、肾、肺、胃、结肠等部位的癌变,是目前为止发现的毒性最大的真菌毒素。黄曲霉毒素可以通过多种途径污染食品和饲料,直接或间接地进入食物链,从而威胁人们的健康和生命安全。目前有100多个国家已经制订了食品中黄曲霉的法规标准及检测方法,我国也已于2011年4月20日发布了《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2011),其规定了食品中黄曲霉毒素的限量指标。《中国药典》2005年版增补本收载了黄曲霉毒素的测定方法,并规定了部分品种的限量值[1]。

大黄䗪虫丸是由熟大黄、土鳖虫、水蛭、虻虫、桃仁、炒苦杏仁、黄芩、地黄、白芍、甘草等十二味药经粉碎、过筛和混匀制成的复方制剂。其功效是活血破瘀,通经消癥。常用于瘀血内停所致的癥瘕、闭经,症见腹部肿块、肌肤甲错、面色黯黑、潮热羸瘦、经闭不行[2]。《中国药典》2020年版一部对其中的土鳖虫、水蛭、桃仁的黄曲霉毒素进行了限量控制[2]。目前对大黄䗪虫丸安全性方面的研究尚未见报道,为进一步保证药品的安全性,本试验参照《中国药典》2020年版四部通则2351及有关文献资料[3-9],采用高效液相色谱法柱后衍生法,对大黄䗪虫丸中黄曲霉毒素进行检测,以了解大黄䗪虫丸中黄曲霉毒素污染状况,并为临床安全用药提供数据资料。

1 仪器与方法

1.1 仪器

Waters e2695高效液相谱仪(带自动进样器、柱温箱、2475荧光检测器、Empower3工作站);梅特勒-托利多XS303S电子分析天平(千分之一);光化学衍生器Huirentek PHRED-HR;高速匀质机D-500(Made by Wiggens);离心机TG16G(湖南凯达科学仪器有限公司)。

1.2 试剂

免疫亲和柱(ROMER,AflaStarTM R,Lot:1000004945);黄曲霉毒素混合标准品溶液(中国食品药品检定研究院610001-201602);甲醇、乙腈均为色谱纯;Ⅰ级纯化水(自制);其他试剂均为分析纯。大黄䗪虫丸(批号为20170908、20171112、20171217、20180503、20180810、20181109、20190505、20191202、20191211、20200610,由某制药公司生产)。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱:Intersil ODS-3 C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温:30 ℃;流动相为甲醇-水,梯度洗脱(比例见表1),流速为1.0 mL/min;柱后衍生-光化学衍生法;荧光检测器,激发波长360 nm,发射波长450 nm,进样量20 μL。

表1 HPLC梯度洗脱表

1.3.2 溶液制备

(1)混合对照品溶液制备。取黄曲霉毒素混合标准品溶液(黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2标示浓度分别为1.02 μg/mL、0.43 μg/mL、1.06 μg/mL、0.38 μg/mL)1.00 mL,加甲醇稀释至50.00 mL,作为储备液,量取储备液1.00 mL,加甲醇稀释至10.00 mL。

(2)供试品溶液制备。取供试品粉末15 g,置均质瓶中,加入氯化钠3 g,精密加入70%甲醇溶液75 mL,高速搅拌2 min(搅拌速度大于11 000 r/min),离心5 min(离心速度4 000 r/min),精密量取上清液15 mL,置50 mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,离心5 min(离心速度4 000 r/min),取上清液20.00 mL,通过免疫亲和柱,流速3 mL/min,用20 mL水洗脱,弃去洗脱液,使空气进入柱子,将水挤出柱子,再加2.00 mL甲醇洗脱,收集洗脱液,用甲醇稀释至2.00 mL,摇匀,用微孔滤膜(0.22 μm)滤过,取滤液备用。

(3)阴性样品溶液制备。取检测无黄曲霉毒素的药材,按照药典制法制成大黄䗪虫丸样品,取样品15 g,同供试品方法制备,即得。

2 结果与分析

2.1 系统适应性试验

按照1.3.1的色谱条件,分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液注入液相色谱仪,记录色谱图(见图1)。由图1可知,黄曲霉毒素各组分完全分离(分离度大于1.5),阴性样品无干扰。

图1 高效液相色谱图

2.2 方法学考察

2.2.1 线性相关性考察

按照1.3.1的色谱条件,精密吸取1.3.2(1)的黄曲霉毒素混合对照品溶液 5 μL、10 μL、15 μL、20 μL 和 25 μL 进行测定,记录色谱图,以对照品量为横坐标(X,pg),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,结果见表2

表2 回归方程及线性范围

2.2.2 精密度试验

按照1.3.1的色谱条件,吸取混合对照品溶液15 μL,进样6次,测定峰面积,结果表明,黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的RSD分别为2.43%,1.86%,2.99%,2.05%,表明仪器的精密度良好。

2.2.3 稳定性试验

取供试品溶液(批号20191202)1.0mL,加入混合对照品溶液0.10 mL,分别制备2 h、4 h、6 h、12 h、16 h和24 h后,按照1.3.1的色谱条件进行测定,结果表明,黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的RSD分别为2.03%,1.98%,2.69%,2.32%,表明供试品溶液在24 h内测定稳定。

2.2.4 重复性试验

取样品(批号20180810),按1.3.2(2)的方法,制备6份供试品溶液,按照1.3.1的色谱条件进行测定。结果表明,黄曲霉素B1的RSD为3.02%,黄曲霉毒素总量的RSD为4.12%,表明该方法重复性良好。

2.2.5 加样回收率试验

精密称取未检出黄曲霉毒素的样品约7.5 g(批号20181109),6份,分别加入1.3.2(1)的黄曲霉毒素混合对照品溶液储备液0.10 mL,按照1.3.2(2)的方法制备,按照1.3.1的色谱条件进行测定,计算黄曲霉毒素的RSD和回收率。结果表明,黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的平均回收率分别为94%,86%,89%,83%;RSD分别为1.89%,1.56%,2.11%,2.03%(n=6)。

2.2.6 检测限和定量限试验

倍比稀释混合对照品溶液,在信噪比约为3时,测得黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测限分别为0.408 pg,0.172 pg,0.424 pg,0.152 pg;在信噪比约为10时,测得黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的定量限分别为1.346 pg,0.585 pg,1.421 pg,0.519 pg。

2.2.7 样品含量测定

取10批次样品,按照1.3.2(2)的方法制备供试品溶液,按照1.3.1的色谱条件进行测定,结果见表3。

表3 样品测定结果(n=2)

3 结论

①本试验中,曾按《中国药典》一部方法选用甲醇-乙腈-水(40∶1842)作为流动相,分离效果不理性,样品中其他成分干扰大,最后选用甲醇-水为流动相进行梯度洗脱,各黄曲霉毒素峰分离效果好,其他成分无干扰。②对10批次样品进行检测,其中有9批中有黄曲霉毒素的检出,结果黄曲霉毒素B1的含量均少于1 μg/kg,黄曲霉毒素的总量均小于2 μg/kg,都低于药典规定的限度值(5 μg/kg,10 μg/kg)。表明大黄䗪虫丸安全性较好,但检出率高到90%,仍应重视黄曲霉毒素的检测。③本方法具有专属性强,操作简单,结果稳定可靠,分离度好等特点,可作为用于大黄䗪虫丸中黄曲霉毒素的含量测定的方法。④大黄䗪虫丸中的熟大黄、桃仁、炒苦杏仁、甘草等及主要辅料蜂蜜,有的属于药食同源,有的可用于保健食品。而本次试验中黄曲霉毒素的检出率极高,相关部门应反思其原料的安全性,尤其上述广泛作为食品使用的药材,进而保证广大消费者的饮食用药安全。

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