姜黄素联合TRAIL诱导人卵巢癌细胞的凋亡及其相关机制

王 敏，曾祚萍，李佳慧，崔君泽，杨淑莉

(吉林大学第二医院 妇产科，吉林 长春130041)

卵巢癌可发生在任何年龄段，50岁以上女性为主要发病群体，通常发现即为晚期，预后较差[1]。卵巢癌患者在持续化疗过程中机体会出现耐药，并且耐药程度会逐渐增加[2]。TRAIL作为TNF相关凋亡的诱导配体，其自身不具明显毒性，TRAIL能上调DR4、DR5的表达从而发挥杀灭肿瘤细胞的作用[3]。姜黄植物根茎的姜黄素经相关研究显示其抗氧化、抗癌及抗炎症方面具有显著优势，如配合其他药物联用可能发挥抗癌功效，促进癌细胞凋亡[4-5]。本文探讨姜黄素联合TRAIL诱导人卵巢癌细胞的凋亡及其相关机制，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料SKOV-3和OVCAR-3细胞株由吉林大学第二医院实验室提供，重组人TRAIL蛋白购自美国RD公司，MTT、DMSO自美国Sigma公司购入，美国Hyclone公司的RPMI1640培养基，细胞凋亡检测试剂盒美国BD公司购置，Caspase活性检测试剂盒由江苏碧云天生物技术研究所支持，酶标仪为美国雷勃公司Thermo Multiskan MK3，流式细胞仪采用美国BD公司Accuri。

1.2 方法

1.2.1细胞复苏、培养、传代及冻存 将冻存管从-150℃超低温冰箱中取出置于37℃水浴箱中，自主晃动使其融化，将细胞悬液放入离心管。将SKOV-3和OVCAR-3细胞株分别置于5 ml含10%新生牛血清RPMI1640培养基，打碎均匀后经800 rpm离心，弃上清，于细胞培养瓶中接种后置于37℃、5%CO2条件下培养，至80%-90%细胞贴壁覆盖进行传代，将旧培养液弃除，并用PBS缓冲液冲洗细胞，在1 ml 0.25%胰酶条件下镜下观察，当细胞质圆润、回缩时加入10%新生牛血清2 ml培养基。将贴壁细胞予以离心处理，按1∶2比例将沉淀白色细胞接种至新培养瓶，置于37℃、5%CO2条件继续培养。取对数生长期细胞，以DMSO/新生牛血清1∶9混合为细胞冻存液，予以离心处理后冻存重悬细胞，浓度调整为1×107/ml，以1 ml进行分装，最终冻存于-150℃超低温冰箱。

1.2.2分组及给药 设置空白对照组(仅SKOV-3和OVCAR-3培养基)、姜黄素组(予以姜黄素浓度为10 μmol/L及50 μmol/L的SKOV-3和OVCAR-3培养基)、TRAIL组(予以重组人TRAIL蛋白浓度为25 ng/ml及75 ng/ml的SKOV-3和OVCAR-3培养基)及姜黄素联合TRAIL组(不同浓度姜黄素与不同浓度的重组人TRAIL蛋白两两配比的SKOV-3和OVCAR-3培养基)。每组3复孔，至70%-80%细胞贴壁融合，作24 h同步化处理后施加相应浓度药物，置于37℃、5%CO2条件继续培养24 h。

1.3 观察指标观察四组细胞活力，细胞凋亡，caspase-3、caspase-8及caspase-9活化的表达水平。其中，①细胞活力：由MTT法检测，细胞活力百分比=(试验吸光度)/(空白对照吸光度)×100%；②细胞凋亡：采用流式细胞术;③caspase-3、caspase-8及caspase-9的表达水平：用Western blot检测caspase-3、caspase-8及caspase-9活化，由Caspase活性检测试剂盒测定。

1.4 统计学分析采用SPSS22.0软件作处理分析，以“均值±标准差”表示，细胞活力，细胞凋亡，caspase-3、caspase-8及caspase-9活化的表达水平采用t检验，若P<0.05，差异认定为有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞活力及增殖抑制效果姜黄素组细胞活力比较，不同浓度下，姜黄素作用于SKOV-3及OVCAR-3细胞的时间越长，细胞活力越低，且两组细胞在姜黄素浓度为50 μmol/L、吸光度时间为48 h时细胞活力达到最低，均低于空白对照组(P<0.05)；TRAIL组细胞活力比较，不同浓度下，重组人TRAIL蛋白作用于SKOV-3及OVCAR-3细胞吸光度的时间越长，细胞活力越低，且两组细胞均于75 ng/ml、吸光度48 h时细胞活力达到最低，与对照组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)；姜黄素组+TRAIL组两两配比不同浓度下，浓度为(10 μmol/L+25 ng/ml)条件下，SKOV-3及OVCAR-3细胞活力随作用时间增加而下降，在(50 μmol/L+75 ng/ml)条件下，SKOV-3及OVCAR-3细胞活力在吸光度48 h时达到最低，与空白对照组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表1、2、3。

表1 姜黄素组细胞活力

表2 TRAIL组细胞活力

表3 姜黄素组联合TRAIL组细胞活力

2.2 细胞凋亡统计SKOV-3及OVCAR-3细胞中各组细胞凋亡率，姜黄素组、TRAIL组及姜黄素组+TRAIL组的细胞凋亡率均高于空白对照组(P<0.05)，且姜黄素组+TRAIL组，不同配比浓度下的凋亡率均大于相应剂量姜黄素组及TRAIL组凋亡率(P<0.05)，见表4。

表4 细胞凋亡

2.3 caspase-3、caspase-8及caspase-9活化姜黄素组、TRAIL组及姜黄素组+TRAIL组caspase-3、caspase-8及caspase-9活化水平与空白对照组比较，均高于空白对照组(P<0.05)，且其中caspase-3活化水平存在显著提升(P<0.05)，见表5、6、7。

表5 姜黄素组caspase-3、caspase-8及caspase-9活化

表6 TRAIL组caspase-3、caspase-8及caspase-9活化

表7 姜黄素组+TRAIL组caspase-3、caspase-8及caspase-9活化

3 讨论

据2015年中国癌症统计数据报告指出：中国卵巢恶性肿瘤发病率为 52.1/10万，死亡率为22.5/10万，对女性生命健康造成极大威胁[6-7]。卵巢恶性肿瘤无典型早期症状，故筛查、诊断难度较高，多数患者首次就诊已为中晚期[8]。目前以根治术辅助化疗为主要治疗手段，可有效抑制肿瘤细胞活性，但持续治疗过程中，机体耐药性上升。TRAIL是TNF超家族成员之一，能特异性诱导肿瘤细胞凋亡，且对正常细胞不具毒性，是临床公认的一种抗肿瘤药物[9-11]。姜黄素为一类植物多酚类化合物，毒性及副作用较小，加上对肿瘤细胞活性有抑制作用，还可与其他化疗药物联合使用提高疗效[12]。本文通过探究姜黄素联合TRAIL诱导人卵巢癌细胞的凋亡及其相关机制，为卵巢癌的治疗提供新思路。

据Iqbal B等学者[13]研究指出：KCL-22髓样细胞施以不同浓度的姜黄素及TRAIL的抗肿瘤效果与单一用药相比，细胞活力明显降低，且该研究认为caspase-3活性增强、NF-κB活性抑制与KCL-22细胞凋亡有一定的关联。本研究则分析了姜黄素、TRAIL在不同浓度下，细胞活力和凋亡情况与作用时间的关系，结果显示：姜黄素组+TRAIL组两两配比浓度下作用于SKOV-3及OVCAR-3细胞，随作用时间延长，于48 h时，两组细胞活力均在配比浓度(50 μmol/L+75 ng/ml)时细胞活力达到最低，且通过抑制率公式计算分析，该时点的抑制率最高。据此可知姜黄素联合TRAIL可发挥细胞增殖抑制效果，在高浓度长时点下细胞增殖抑制效果明显提升。而姜黄素组+TRAIL组配比浓度为(50 μmol/L+75 ng/ml)时的肿瘤细胞凋亡效果最佳，与同一浓度下单一药物凋亡率比较，联合用药凋亡率明显更高，推测上述两种药物联合应用可发挥协同效果，诱导凋亡效果更佳。究其原因，可能与Obaidi I等学者[14]及Kong WY等学者[15]相关研究中TRAIL所起增敏效果与人乳腺腺癌细胞诱导凋亡有密切联系。另从caspase-3、caspase-8及caspase-9活化结果表明：姜黄素组+TRAIL组中caspase-3活性变化幅度相较于caspase-8及caspase-9活化更高，具有明显差异，分析原因可能caspase-3属与诱导凋亡必要通路有关。这与据Kamat AM等学者[16]研究报道所称姜黄素可通过抑制NF-κB和诱导膀胱癌细胞中的TRAIL受体来增强BCG的抗肿瘤作用结果相似。现从分子生物学、细胞学、组织学等角度上分析姜黄素的抗肿瘤细胞作用机制，可能因素如下[17]：①在分子水平上，肿瘤细胞摄取姜黄素，药物作用靶点增加，可调节肿瘤细胞的信号转导，从而促进肿瘤细胞中某些酶、蛋白质和基因的表达；②在细胞水平上，姜黄素抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，肿瘤细胞多药耐药情况得以逆转，进而增强NK细胞的细胞毒性；③在组织水平上，可抑制肿瘤血管生成。同时，姜黄素对人体的毒性和副作用较小，比一般化疗药物更能特异性地杀伤肿瘤细胞，且可联合其他药物增加放化疗对肿瘤细胞的杀伤作用。这与Kamalabadi-Farahani M等学者[18]研究报道DR-5基因在原发性和转移性肿瘤细胞中均上调，但与转移性细胞相比，原发性肿瘤细胞中上调幅度更高，呈一定相关性。

综上所述：姜黄素联合TRAIL对于卵巢癌具有细胞增殖抑制效果，可通过增强caspase-3活性有效诱导了细胞凋亡，以50 μmol/L姜黄素+75 ng/ml重组人TRAIL蛋白诱导效果最佳，在考虑毒性情况下合理配比，可提升卵巢癌临床治疗效果，在后续卵巢癌研究中具有一定参考价值。