基于网络药理学探讨马齿苋药理作用的分子机制

张伟

开封市儿童医院，河南 开封 475000

马齿苋，又名长寿菜，为常见的药食同源的中药，来源广，应用广泛，内服用于治疗痢疾，有降糖、降脂等作用［1］，外用可以治疗湿疹、扁平疣和尖锐湿疣等［2－3］。其性寒味酸，入大肠、肝、脾经，有清热解毒、消痈利尿之功效，适用于湿热或热毒所致的痢疾、痈肿和淋症等［4］。有研究表明，其性寒滑利，清血分及大肠热毒，为中医临床治痢疾的常用品，有“痢疾克星”之称［5］。《本草纲目》记载“散血消肿，利肠滑胎，解毒通淋，治产后虚汗”。中药因其成分复杂，靶点众多，应用网络药理学研究中药药理作用的分子作用机制有重要意义。

本研究通过收集整理马齿苋的主要成分和作用靶点，构建成分靶点网络，采用网络药理学的方法分析马齿苋药理作用的分子机制，为寻找马齿苋潜在的药理作用提供了依据。

1 方法

1.1 活性成分及靶标蛋白的筛选通过中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology data base and analysis platform，TCMSP）［6］（http：／／tcmspw.com／tcmsp.php）检索“马齿苋”。口服生物利用度（oral availability，OB），即口服后药物以原型形式进入血液循环的相对量，是确定药物生物活性，可作为药物的关键指标，筛选值≥30%。类似性（drug－likeness，DL）是基于相似性原理，总体相似的分子应具有相似的生物活性；DL≥0.18，即“类药物”化合物的选择标准。根据活性成分在相关靶点中选出相应的靶点蛋白名称。

1.2 靶蛋白的基因symbol确定及成分－靶基因网络的构建通过UNIPROT［7］数据库（https：／／www.uniprot.org／）和GENECARDS［8］（https：／／www.genecards.org／）数据库将靶点蛋白转化为相应的gene symbol，采用Cytoscope3.6.0软件构建成分－靶基因网络图。

1.3 构建蛋白相互作用（protein－protein interation，PPI）网络应用STRING［9］（https：／／stringdb.org／）数据库构建相关靶蛋白的PPI网络，并根据度值筛选核心网络作用图。

1.4 靶蛋白的富集分析采用在线富集分析网站Metascape［10］（https：／／metascape.org／gp／index.html）对靶点蛋白进行GO富集分析和KEGG通路富集。

1.5 实验流程图见图1。

图1 实验流程图

2 结果

2.1 活性化合物的筛选结果从马齿苋中共筛选出10种（占54种化合物的18.52%）具有良好的口服生物利用度（OB≥30%）和类药性（DL≥0.18）的化合物。见表1。

表1 马齿苋活性化合物筛选结果

2.2 化合物－靶点相互作用网络共筛选出靶点221个蛋白基因。化合物－靶蛋白基因相互作用网络图，见图2。

图2 马龄苋有效成分－靶点作用网络图

2.3 靶基因相互作用网络（PPI分析）及高连接子图筛选将所有靶基因数据导入STRING数据库中进行PPI分析，PPI网络图共212个节点，3 898条边，网络异构度为0.808，聚集系数为0.585，PPI富集P＜0.001，蛋白相互作用包括共表达、共现、融合、调控和注释途径等相互作用［11］。度值前10位节点的拓扑学参数，见表2。蛋白质网络中节点度值越大，表明该蛋白质参与的相互作用越多，体现了该蛋白质与周围蛋白质之间的直接联系的能力更强，对于蛋白质网络的影响力就越大，该蛋白质是关键蛋白质的可能性越大［12］。度值最高的AKT1是丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶之一，调节多种过程，包括代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成［13－15］。ALB为血浆白蛋白，在调节血浆胶体渗透压中起到重要作用，并充当多种内源性分子及外源性药物的载体蛋白［16］。白细胞介素－6（interleukin－6，IL－6）参与炎症反应，在急性期参与B细胞活化［17］。TP53、TNF、VEGFA、CASP3、JUN、MAPK8均参与肿瘤的生成和坏死［18－23］。见图3。

表2 度值前10位蛋白的拓扑学参数

图3 PPI作用网络及核心网络筛选图

2.4 靶蛋白基因GO富集分析和KEGG富集分析GO富集分析和KEGG通络富集均在Metascape（https：／／metascape.org／gp／index.html）上完成，GO富集分析包括生物过程（biological progress，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞成分（cellular component，CC）。选取显著性前20位富集结果做气泡图，图4为BP富集结果，图5为MF富集结果，图6为CC富集结果，图7为KEGG通路富集结果。MF富集分析显示了作用靶点多具有与配体激活的转录因子活性、核受体激活、类固醇激素受体激活、铵离子结合、神经递质受体激活等分子功能，BP富集分析主要包括对有机环状化合物反应过程、对有毒物质反应过程、对无机物的反应过程等；CC富集分析显示这些靶点蛋白主要分布在突触后膜、细胞质核周区域、细胞外基质等；主要的通路包括癌症通路、乙型肝炎通路、动脉粥样硬化通路等。说明马齿苋作用范围广泛，通过多种途径调节机体功能，包括肿瘤形成、乙型肝炎、动脉粥样硬化等。

图4 BP富集分析气泡图

图5 MF富集分析气泡图

图6 CC富集分析气泡图

图7 KEGG富集分析气泡图

颜色由绿到红为－log10（fdr）范围从小到大，－lg（fdr）越大说明显著性越强，fdr为调整后P值，即q值），气泡大小为富集的基因数目，纵坐标为各个富集的名称，横坐标为富集倍数。

3 讨论

本研究通过对马齿苋的有效成分进行筛选，寻找靶点蛋白，转换成靶点基因，靶基因相互作用和富集分析来研究马齿苋药理作用的分子机制。符合多靶点、多通路和多种分子机制共同作用的条件。有效成分的筛选仅仅从口服生物利用度和参数方面考虑，没有考虑有效成分在马齿苋中的含量浓度，可能会存在一定的误差。

蛋白质不能独立执行生物功能，而是通过相互作用以协作的方式完成生物功能，PPI在生命活动中起到核心作用。PPI是互相作用的蛋白质在物理上的接触，形成蛋白质复合物或短暂接触后又发生了分离［24］。通过PPI网络分析，发现马齿苋作用的主要蛋白AKT1参与炎症、癌症、糖尿病及心血管疾病等的发生发展。研究表明，AKT信号通路在心肌肥厚和重塑中起着重要作用［25］。马齿苋前10的作用靶点分子中除了AKT1，IL－6、TNF也是炎症反应中重要的细胞因子。IL－6是细胞因子网络中重要成员，在急性炎症反应中处于中心地位，可诱导产生C反应蛋白和降钙素原生成，与炎性疾病及感染程度直接相关［26］。研究发现，马齿苋可以抑制IL－6表达，抑制溃疡性结肠炎的癌变［27］。前10作用分子中其他靶点参与肿瘤发展、细胞分裂等。研究表明，马齿苋中提取的多糖能提高小鼠的免疫功能，同时也可直接抑制肿瘤细胞分裂［28］。有实验发现，马齿苋通过驱邪扶正作用起到抗病毒作用［29］。富集分析结果显示了马齿苋的靶蛋白多参与细胞分裂、转录调节等生物过程。这些研究结果均与基因富集分析结果中靶基因蛋白所参与的多条癌症通路及心血管疾病通路相对应。有研究表明，马齿苋提取液具有抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌等作用［30］，本研究重点关注于马齿苋在人体中潜在存在的靶点蛋白的作用，其他生物的靶点蛋白不在考虑范围内。

本研究仅分析了马齿苋的作用分子机制，没有把相关疾病靶点映射到其作用靶点中，探讨马齿苋与某种疾病的关系。后续研究要注意把相关疾病与马齿苋作用靶点相互映射，为中药治疗相关疾病的开发提供依据。