基于网络药理学探析玉液汤对2型糖尿病的作用机制

刘坚辉， 陈楚仪， 杨帏勋， 刘 敏

(1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405；3.东莞仁康医院，广东 东莞 523952)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)是以胰岛素抵抗和(或)胰岛素分泌障碍引起的一组以葡萄糖和脂肪代谢紊乱，血浆葡萄糖水平增高为特征的代谢内分泌疾病。目前对于T2DM的治疗主要有以下方式：饮食治疗、运动疗法、口服抗糖尿病药、胰岛素治疗，GLP-1类似物及减肥手术为主。中医方面，糖尿病当属于中医“消渴病”范畴，其以“三多一少”即饮多、食多、尿多、身体消瘦为特点，辩证当属“气阴两虚”，病位在肺、脾、肾三脏，治疗当以“益气生津”为主。

玉液汤出自清代名医张锡纯所著的《医学衷中参西录》[1]，用以治疗消渴病，张氏于书中描述此方配伍说：“消渴一证，多由于元气不升，此方乃升元气以止渴者也。方中以黄芪为主，得葛根能升元气。而又佐以山药、知母、花粉以大滋真阴，使之阳升而阴应，自有云行雨施之妙也。用鸡内金者，因此证尿中皆含有糖质，用之以助脾胃强健，化饮食中糖质为津液也。用五味者，取其酸收之性，大能封固肾关，不使水饮急于下趋也。”明确提出玉液汤用以治疗消渴病。而在临床应用上，玉液汤已被广泛用以治疗糖尿病以及其所引起的包括糖尿病肾病在内的并发症。

但由于复方中药成分多样性，以及与人体相互作用机制复杂的问题，目前发掘其明确的作用机制仍相对困难。故希望借助近年发展迅速的网络药理学方法，基于系统生物学的角度挖掘玉液汤治疗2型糖尿病的作用机理，为以后进一步验证实验提供参考基础。

1 方法

1.1 收集玉液汤的生物信息数据 利用BATMAN-TCM数据库收集玉液汤的相关成分及靶点数据。BATMAN-TCM是在线生物信息分析工具，主要用于分析中药成分及潜在靶点，且该数据库可输入单味中药或者以君臣佐使形式输入中药复方进行分析以及对复方中药或单味药进行网络药理学分析。本次研究以玉液汤作为研究对象，输入山药、黄芪作为君药，知母、天花粉作为臣药，鸡内金、五味子、葛根作为佐使药，一共3个集群，设定P≤0.05，score cutoff≥20为检索条件。并将得出的与玉液汤相关的化合物成分输入中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，通过口服利用度(Oral Bioavailability，OB)，类药性(Drug-Likeness，DL)作为筛选标准，设定OB≥30%，DL≥0.18，得出玉液汤的生物信息集[2]。

1.2 获取2型糖尿病的生物信息数据 在DrugBank(https://www.drugbank.ca/)上输入“type 2 diabetes mellitus”寻找2型糖尿病的相关基因，并运用UniPort(https://www.uniprot.org/)数据库对靶点进行标准化命名。

1.3 获取玉液汤-2型糖尿病-基因数据 通过OmicShare平台(https://www.omicshare.com/)对获得的玉液汤靶点以及2型糖尿病的相关基因进行映射分析，得出玉液汤-2型糖尿病-基因数据集，并绘制韦恩图。将玉液汤-2型糖尿病-基因数据集输入STRING 11.0数据库(https://string-db.org/)，设定综合分数>0.4，删除无连接的节点为筛选标准进行分析，并将得出的数据录入Cytoscape 3.6.1软件进行可视化分析，对其进行网络拓扑学参数分析，得出作用显著的节点。

1.4 基因本体(GO)分析 将玉液汤-2型糖尿病-基因数据集导入DAVID 6.8 数据(https://david.ncifcrf.gov/)进行GO分析，得出结论后，以P≤0.05为筛选标准进行筛选，从而得出基因的功能水平。

1.5 京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析 将玉液汤-2型糖尿病-基因数据集导入DAVID 6.8 数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行KEGG分析，以P≤0.05为筛选标准进行筛选，从而得出其富集的生物学通路。

2 结果

2.1 玉液汤的生物信息数据 经过BATMAN-TCM检索后，剔除无效成分，共得到293个化合物，由于化合物较多，故录入TCMSP筛选后只显示各个群集OB≥30%、DL≥0.18的化合物，见表1。玉液汤的主要生物通路富集在视黄醇代谢，钙信号通路，心肌细胞肾上腺素能信号转导，糖酵解/糖异生，逆行内源性大麻素信号转导，谷氨酸能突触，酪氨酸代谢，甲状腺激素信号途径，神经活性配体-受体相互作用，多巴胺能突触，脂肪酸降解，胆碱能突触，昼夜夹带，心肌收缩，催产素信号通路，cGMP-PKG信号通路，胰岛素分泌，γ-氨基丁酸能突触，5-羟色胺能突触；分子功能(Molecular function，MF)主要富集在转录因子活性，蛋白质结合，信号传感器活动，脂质结合，氧化还原酶活性，转移酶活性，转移酰基等；细胞组分(Cellular component，CC)主要富集在胞浆，质膜，核染色体，内质网，过氧化物酶体等；生物过程(Biological process，BP)主要富集在蛋白质靶向，细胞骨架依赖性细胞内转运，神经系统过程，蛋白质复合物组装，trna代谢过程等。网络所示为OB≥30%、DL≥0.18的化合物与靶点网络图，见图1。

表1 玉液汤中具有较好口服利用度及类药性的化合物

图1 玉液汤中OB≥30%、DL≥0.18的化合物网络关系图(粉红色代表化合物，绿色代表靶点)

本次通过BATMAN-TCM检索筛选后，共得出1 680个靶点，以君，臣，佐使形式分为3个合集，共同靶点403个，见图2，对其进行PPI互作网络分析以及拓扑学分析后，发现其相互作用较强的靶点为胰岛素、白细胞介素6、肿瘤坏死因子、FOS蛋白、多巴胺受体D2等，进一步说明玉液汤是通过多靶点协同作用发挥治疗疾病的作用,见表2。

表2 玉液汤君、臣、佐使的共同基因PPI网络拓扑学分析

2.2 2型糖尿病的生物信息数据 通过DrugBank对“type 2 diabetes”进行检索以及通过Uniport对靶基因进行标准化命名后，得到197个基因，删除重复基因后，共得到108个基因与2型糖尿病相关，其生物信号通路主要富集于视黄醇代谢、药物代谢-细胞色素p450、胆汁分泌、细胞色素p450对外源物质代谢的影响、5-羟色胺能突触、神经活性配体-受体相互作用。分子功能(Molecular function，MF)主要富集在atp酶活性与物质跨膜运动，氧结合，类固醇羟化酶，药物结合，阴离子跨膜转运atp酶活性等；生物过程(Biological process，BP)主要富集在药物反应，外源代谢过程，类固醇代谢过程，阴离子跨膜转运，药物代谢过程等；细胞组分(Cellular component，CC)主要富集于质膜的整体组成，质膜，细胞器膜，膜的整体组成，内质网膜等,见图3。

注：左图为玉液汤的君、臣、佐使的各项基因靶点数，右图为玉液汤的君、臣、佐使的共同基因PPI网络集。图2 玉液汤的基因靶点集

图3 2型糖尿病的基因靶点集

2.3 玉液汤-2型糖尿病-基因数据 将玉液汤的1 680个靶点与2型糖尿病的108个靶点导入OmicShare平台进行映射，共得出交集基因61个，将其录入STRINGpingt进行蛋白与蛋白PPI互作分析，并运用Cytoscape的NetworkAnalyzer功能进行网络拓扑学分析，得出其较关键的基因为白蛋白(ALB，Degree为21)、细胞色素P4503A4(CYP3A4，Degree为20)、单胺氧化酶(MAOB，Degree为20)、SLCO1B1基因、三磷酸腺苷结合盒运转体A1(ABCA1，Degree为15)等。如图4所示，节点颜色越深，则代表该节点的度(degree)越高，代表其在PPI网络中起着更关键的作用，其中三角形节点代表玉液汤-2型糖尿病的共同基因靶点，边代表基因间的相互作用关系，玉液汤-2型糖尿病-基因的PPI互作网络共有节点60个及248个相互作用联系。

注：左图为玉液汤-2型糖尿病相互交联的基因靶点数，右图为玉液汤-2型糖尿病相互交联的基因靶点PPI 网络(颜色越深，作用越强)。图4 玉液汤-2型糖尿病-基因的数据集分析

2.4 玉液汤-2型糖尿病-基因的生物学过程 将玉液汤-2型糖尿病的交集基因录入DAVID 6.8数据库进行GO分析，并以P≤0.05为筛选标准进行筛选，得出结果后，按照其显性程度进行部分排列展示，GO分析提示玉液汤-2型糖尿病-基因主要的生物学过程显著富集在药物反应、腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、磷脂酶c激活g蛋白偶联受体信号途径、药物跨膜转运、行为调节、5-羟色胺受体信号通路、突触传递，多巴胺能、可卡因的行为反应、去甲肾上腺素肾上腺素血管收缩与系统性动脉血压的调节、游离钙离子在胞浆中的释放、血管收缩等；分子功能主要富集在药物结合、血清素结合、神经递质受体活性、G蛋白偶联5-羟色胺受体活性、多巴胺神经递质受体活性、多巴胺结合、atp酶活性与物质跨膜运动等；细胞组分主要富集在质膜的整体组成、质膜等，见表3。

表3 玉液汤-2型糖尿病-基因的生物学过程

2.5 玉液汤-2型糖尿病-基因的生物学通路 将玉液汤-2型糖尿病的交集基因录入DAVID 6.8数据库进行KEGG分析，共得到24条通路，并以P≤0.05为筛选标准进行筛选，得出结果后，按照其显性程度进行部分排列展示，见表4。KEGG分析提示玉液汤-2型糖尿病-基因主要的生物学过程显著富集在神经活性配体-受体相互作用、过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路、胆汁分泌、5-羟色胺能突触、ABC转运蛋白、钙信号通路等。

表4 玉液汤-2型糖尿病-基因的生物学通路

3 讨论

本研究通过BATMAN-TCM检索获得玉液汤化学成分108种、靶点1 680个，可能与视黄醇代谢、药物代谢-细胞色素p450、胆汁分泌、细胞色素p450对外源物质代谢的影响、5-羟色胺能突触、神经活性配体-受体相互作用等有关，可发挥协同作用以调控2型糖尿病。

3.1 玉液汤具有调节关键靶点的潜在作用 本研究通过PPI蛋白互作网分析，得出玉液汤中蛋白互作性较强的靶点。其中ABL是2型糖尿病早期诊断、病情进展和监测的重要指标，2型糖尿病肾脏损伤越大，其ALB丢失则越多[3]；CYP3A4是细胞色素P540氧化酶家族成员之一，随2型糖尿病胰岛素抵抗的增强会导致CYP3A4蛋白活性下降[4]；MAOB是存在于胰岛当中的酶，2型糖尿病β细胞中其表达显著降低，导致β细胞功能障碍[5]；SLCO1B1是溶质载体有机阴离子转运体家族成员之一，其基因多态性对药物代谢、治疗效果及相关不良反应方面有影响[6]；ABCA1可影响胰岛β细胞，是维持正常胰岛素分泌的关键作用，对胆固醇逆向转运与高密度脂蛋白生成起重要作用，胆固醇可能抑制胰岛素分泌[7]。

3.2 玉液汤在调节生物学通路方面的作用 对玉液汤与2型糖尿病的共同基因进行KEGG富集分析，发现该方对神经活性配体-受体相互作用通路进行调节，有促炎、抗炎作用，对2型糖尿病的发展和治疗有直接作用[8]。有研究发现，PPARs能调控脂质代谢过程，也调节糖代谢，与脂肪酸代谢、脂肪酸β氧化和转运调节脂质平衡有关[9]。胆汁酸是影响血糖稳定的重要因素，除了影响脂肪的消化和吸收外，在大肠及小肠中可诱导2型糖尿病药物的关键作用靶点胰高血糖素样肽-1的分泌，调节肠道微生物菌群的组成，减少2型糖尿病患者餐后血糖的上升[10]。通过KEGG富集分析发现，玉液汤作用于胆汁分泌通路，对2型糖尿病的调控亦与5-羟色胺能突触有关。有研究证明，胰岛素分泌代谢亦受到了5-羟色胺等单胺类神经递质控制[6]，其中ABCA1转运体与糖尿病发病机制有关，小鼠胰岛β细胞中缺失ABCA1后，出现了葡萄糖不耐受等情况[11]，而玉液汤可能对ABC转运体进行调控，从而对2型糖尿病起调控作用。本研究发现，玉液汤对2型糖尿病的调控亦与钙信号通路有关，可促进AKT活化和钙相关的eNOS活化，并参与了调节AKT2B1抑制HUVECs的胰岛素敏感性[12]。

综上所述，玉液汤具体多靶点、多通路的特点，可能透过调控ALB，CYP3A4，MAOB，SLCO1B1， ABCA1等多个靶点，以及作用于神经活性配体-受体相互作用、过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路、胆汁分泌、5-羟色胺能突触、ABC转运蛋白、钙信号通路等多条通路对2型糖尿病起到治疗作用。但鉴于网络药理学的局限性，本研究未发现基因表达与通路的正负调节关系，因此仍需进一步探索玉液汤作用于2型糖尿病的机制。