辛夷、辛夷仁和辛夷外苞片中非挥发性成分比较

渠亚蓉， 胡 静， 周 琪， 张 敏， 章弘扬， 胡 坪*

(1.华东理工大学化学与分子工程学院，上海市功能性材料化学重点实验室，上海 200237；2.华东理工大学药学院，上海市新药设计重点实验室，上海 200237)

辛夷，为望春花MagnoliabiondiiPamp.、玉兰MagnoliadenudateDesr.或武当玉兰MagnoliasprengeriPamp.的干燥花蕾[1]，其性温味辛，归肺胃经，可以散风寒、通鼻窍[2]。从部位角度，可将辛夷全花蕾可分为外苞片和辛夷仁两部分。明、清之前，含有辛夷的古方中一般以辛夷仁入药，如宋代《严氏济生方》[3]所载“辛夷散”。至明、清时期，诸多含辛夷仁的经典名方历经时代演变，逐步以辛夷代替辛夷仁，如《惠直堂经验方》[4]中“辛夷散”。近年来，古代经典名方的开发受到国家高度重视，其中不乏含辛夷仁的方剂[5-6]，而辛夷仁是否能用当前市场上流通的辛夷取代还值得商榷。

辛夷中的化学成分种类繁多，可分为挥发油类、生物碱类、黄酮苷类和木脂素类等[7]。其中挥发油和木脂素是辛夷的主要药效成分[8-10]。本课题组前期已对辛夷、辛夷仁、辛夷苞片中的挥发性成分进行对比研究，发现辛夷仁所含挥发性成分种类与辛夷一致，但含量远高于辛夷[11]。

本实验进一步对辛夷及辛夷仁的非挥发性成分展开研究，建立辛夷非挥发性成分的超高效液相色谱指纹图谱，利用LC-MS对其中的主要色谱峰进行鉴定，结合主成分分析和PLS-DA寻找辛夷不同部位的差异性成分，旨在为经典名方中辛夷的合理使用提供科学依据。

1 材料

Waters Acquity超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Agilent 1290 UHPLC-6530 QTOF-MS/MS液质联用仪[安捷伦科技(中国)有限公司]；EPED-E2-10TF实验室超纯水机(南京易普易达科技发展有限公司)；CPA225D型分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]。乙腈和甲酸均为色谱纯、磷酸为分析纯(上海泰坦科技有限公司)。木兰脂素(110882-201708，中国食品药品检定研究院)。辛夷药材由神威药业集团有限公司提供，并经河北省食品药品检验院孙宝惠主任中药师鉴定为望春花MagnoliabiondiiPamp.干燥花蕾。

2 方法与结果

2.1 木兰脂素含量测定 对来自3个不同产地共15批的辛夷药材进行手工处理，获得对应批次的辛夷仁和辛夷苞片，测得辛夷仁在辛夷全花蕾中所占比例约为30%～35%。木兰脂素的含量测定参照2020年版《中国药典》方法进行，采用外标法进行定量分析，木兰脂素的回归方程为Y=5 326.26X-19.162(r=0.999 9)，结果见表1。

表1 15批辛夷不同部位的木兰脂素含量(%，n=2)

2.2 辛夷UHPLC指纹图谱建立

2.2.1 色谱条件 Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流动相乙腈(A)-水(含0.1%磷酸)(B)，梯度洗脱(0 min，10% A；0～16 min，10%～18%A；16～30 min，18%～55% A；30～35 min，55%～100%A；35～40 min，100% A)；检测波长254 nm；体积流量0.2 mL/min；柱温30 ℃；进样量1 μL。

2.2.2 溶液制备 取辛夷、辛夷仁、外苞片粗粉各约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声(500 W、40 kHz)提取50 min，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取木兰脂素对照品适量，精密称定，置于25 mL量瓶中，加甲醇制备成质量浓度为0.542 7 mg/mL的参照峰溶液。

2.2.3 UHPLC指纹图谱方法学验证 取同一份辛夷供试品溶液，在“2.2.1”项条件下连续进样6次，记录色谱图，对仪器的精密度进行考察。取同一批号的辛夷，平行制备6份供试品溶液，记录所得色谱图，对重复性进行考察。取同一份供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、24 h进样，记录所得色谱图，对稳定性进行考察。分别计算图1(B)中10个特征峰(1～10号峰)相对于参照峰木兰脂素(S)的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，精密度、重复性、稳定性试验中，各特征峰相对保留时间RSD均小于1.0%，相对峰面积RSD均小于5.0%，方法验证结果符合指纹图谱分析的要求。

注：A～C分别为辛夷仁、辛夷、辛夷外苞片。图1 各样品UHPLC特征图谱

2.2.4 UHPLC指纹图谱测定及相似度评价 取“2.2.2”项下供试品溶液，在“2.2.1”项条件下进样，色谱图见图1。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)，计算15批辛夷全花蕾、辛夷仁和外苞片UHPLC特征图谱与对照谱图的相似度，结果见表2。

2.3 不同部位非挥发性成分的液质联用定性分析

2.3.1 分析条件 液相色谱条件同“2.2.1”项，仅以水(含0.1%甲酸)代替水(含0.1%磷酸)作为流动相B。采用正、负离子扫描模式；质量扫描范围m/z50～1 500；采集一级质谱数据；雾化温度350 ℃；雾化气体积流量10 L/min；雾化气压30 psi(1 psi=6.895 kPa)；毛细管电压正模式为3 000 V，负模式为3 500 V；Skimmer 电压65 V；八极杆射频电压750 V；毛细管出口电压150 V。目标二级离子模式(Targeted MS/MS)的碰撞电压值依据目标离子碎裂的难易程度设定为20、40 eV。

2.3.2 数据处理 取“2.2.2”项下供试品溶液，在“2.3.1”项条件下进样，不同模式下辛夷的总离子流图见图2。采用MassHunter Qualitative Analysis B.06.00软件进行数据处理，通过一级质谱得到的精确分子量计算分子式，结合对二级质谱裂解规律的研究，参照文献[12-18]，共鉴定出21种成分，见表3～4，其中6种生物碱类，4种苯乙醇苷类，3种黄酮苷类，8种木脂素类。结果表明，辛夷仁中的非挥发性成分以木脂素类为主，生物碱的含量很少；而辛夷外苞片中的木脂素类含量极低，但生物碱含量显著高于辛夷仁。

图2 辛夷不同模式下总离子图

表3 成分鉴定结果及二级质谱数据(正离子模式)

表4 成分鉴定结果及二级质谱数据(负离子模式)

2.4 主成分分析 以“2.2.4”项下获得的15批辛夷不同部位的UHPLC指纹图谱中各色谱峰峰面积与试样质量的比(色谱峰保留时间>2 min，峰面积占比≥0.4%)为特征值，利用SIMCA 13.0软件得到的主成分分析图见图3。为找出辛夷不同部位间的差异性特征成分，还进行了偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)，依次提取4种主成分，分别生成载荷散点图和VIP值图，见图4～5。

注：图中菱形为辛夷仁，方形为辛夷，圆形为辛夷苞片。图3 辛夷、辛夷仁和辛夷苞片主成分分析得分图

图4 辛夷、辛夷仁和辛夷苞片PLS-DA载荷散点图

图5 辛夷、辛夷仁和辛夷苞片VIP值图

3 讨论

3.1 不同部位中木兰脂素含量的比较 由表1可见，木兰脂素在辛夷仁中的平均含量为10.30%，远高于其全花蕾和外苞片。可见辛夷仁部位是辛夷全花蕾中木兰脂素的主要来源部位。

3.2 不同部位指纹图谱的相似度分析 由表2可知，辛夷仁的指纹图谱相似度在0.931～0.967之间，与辛夷全花蕾和外苞片相比较高，说明这15批辛夷仁的质量较为一致。而外苞片的相似度偏低，在0.361～0.564之间，提示该部位与另2个药用部位的质量存在较大差异。

3.3 不同部位UHPLC指纹图谱的差异分析 由辛夷、辛夷仁和辛夷外苞片的UHPLC指纹图谱(图1)可知，三者所含非挥发性成分的种类基本一致，但同一成分的含量在不同部位差异显著。2～10 min的色谱峰在辛夷仁中峰高较低，在外苞片中的峰高较高，例如特征性较强的3号色谱峰木兰碱(图2中的5号峰)。而30～40 min的色谱峰在辛夷仁部位中的峰高要远远高于外苞片及全花蕾部位，例如对照峰木兰脂素，这与“2.1”项下木兰脂素含量测定结果具有一致性。

3.4 不同部位非挥发性成分的主成分分析 15批辛夷不同部位的PCA得分图中，辛夷、辛夷仁和辛夷苞片的数据分布在3个相对独立的区域，提示这3种不同部位的非挥发性物质在成分含量上存在明显差异，证明辛夷仁药材有别于辛夷全花蕾。这与本课题组之前对辛夷不同部位挥发性成分的PCA分析结果[11]相似。

在载荷散点图图4中，有4个成分与主要化合物团偏离最远，表明这4个成分在样本分类中的作用最大。本模型的VIP值如图5所示，该数值代表变量重要性投影值，VIP值越高，代表该变量化合物对辛夷及其不同部位质量差异的贡献越大，因此VIP值最高(VIP>1.6)的4个非挥发性成分——木兰脂素、D-乌药碱、松脂素二甲醚和木兰碱即为辛夷仁和辛夷外苞片间的差异性成分。

有研究者指出，辛夷的入药成分主要为木兰脂素和松脂素二甲醚等木脂素类化合物[18]。亦有动物实验研究显示，辛夷中的酚酸性生物碱如柳叶木兰碱、木兰箭毒碱等均存在箭毒样作用，且多会经肠道缓慢吸收，存在一定毒性[12]。因此，从物质基础的角度考虑，去除富含酚酸性生物碱的外苞片，仅以木脂素类成分含量更高的辛夷仁入药，不仅可避免苞片茸毛的刺激，还能降低毒性风险，提高药效。经典名方中以辛夷仁入药有其合理性和科学性。