三孢布拉霉遗传转化体系的构建及应用

李 娜， 曲音波， 杨培龙， 余晓斌， 罗 玮*

（1.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122；2.山东大学 微生物技术国家重点实验室，山东 青岛266237；3.中国农业科学院饲料研究所 农业农村部饲料生物技术重点实验室，北京100081）

三孢布拉霉（Blakeslea trispora）是一种重要的丝状真菌，因其具有类胡萝卜素积累量高、工艺相对简单、成本较低和易于提取等优点，可用于工业大规模生产类胡萝卜素。目前，对于三孢布拉霉的研究主要集中在通过传统诱变选育手段获得类胡萝卜素高效合成菌株，但该技术工作量大、效率低，且获得的菌株容易出现退化[1]。采用系统代谢工程策略和合成生物学技术无疑是解决上述问题的最好替代方法，但是目前缺乏针对三孢布拉霉的高效遗传转化工具。

根癌农杆菌介导转化（Agrobacterium tumefaciensmediated transformation，ATMT）是依靠T-DNA在诱导条件下转移基因到宿主基因组中的能力，将外源基因导入宿主的转化技术[2]，已成功在卷枝毛霉[3]、里氏木霉[4]等丝状真菌得到应用。相比于其他遗传转化方法，ATMT具有转化效率高、侵染受体选择多样等优点[5]，已是丝状真菌遗传转化系统中常用的方法。黄琼瑶[6]首次证明农杆菌介导三孢布拉霉孢子遗传转化的可行性。但在研究中发现农杆菌介导的孢子转化法难以得到转化子，其原因可能是孢子细胞壁厚的缘故。

由ku80基因编码的ku80蛋白是组成ku蛋白的两个亚基之一，最早是在患有多肌炎硬皮病重叠综合征的日本姓ku的患者血清中发现[7]，因该亚基的相对分子质量大小为83 000，故命名为ku80[8]。Ku80参与的非同源末端连接（NHEJ）修复途径，是造成三孢布拉霉等丝状真菌敲除困难的原因之一[9]。有研究表明对丝状真菌中涉及NHEJ的相关基因进行敲除后，能够提高同源重组（HR）频率[10]，比如在黑曲霉[11]、粗糙脉孢霉[12]、大丽花轮枝孢[13-14]、里氏木霉[15]中均有研究报道。本研究中通过根癌农杆菌介导三孢布拉霉原生质体转化的方法，导入敲除片段进三孢布拉霉基因组，从而实现ku80基因的敲除。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒野生型三孢布拉霉（Blakeslea trispora）负菌NRRL2896、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、质粒pDHt-sk、质粒pCSN44：作者所在实验室保藏；根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404：购自苏州金唯智公司；载体pMD18-T：购自大连宝生物工程有限公司。

1.1.2 抗生素和试剂卡那霉素、利福平、潮霉素B、头孢噻肟钠、乙酰丁香酮（AS）：上海生物工程公司产品；DNA抽提试剂盒、胶回收试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司产品；HiScript II One Step RTPCR Kit（Dye Plus）试剂盒、EsTaq聚合酶：南京诺唯赞生物公司产品；高保真酶PrimerSTAR Max酶，限制性内切酶SmaⅠ、XhoⅠ：TaKaRa公司产品；溶壁酶、纤维素酶、蜗牛酶：北京索莱宝公司产品；引物合成及测序：苏州金唯智公司提供；其他试剂：国药集团化学试剂有限公司产品。

1.1.3 培养基LB培养基（胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L）用于大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌LBA4404的培养；糖度5°麦汁培养基和种子培养基（玉米粉30 g/L，大豆粉50 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L；pH 6.5）用 于 三 孢 布 拉 霉NRRL2896的培养。

1.1.4 引物实验中用到的引物序列见表1。

表1 实验中用到的引物Table 1 Primers used in this experiment

1.2 方法

1.2.1 三孢布拉霉ku80基因的克隆在NCBI中，根据瓜笄霉ku80（OBZ83437.1）蛋白质序列，在三孢布拉霉全基因组中进行tblast，找到ku80基因序列，设计Ku80-F和Ku80-R引物扩增得到Btku80基因（三孢布拉霉的ku80基因）。以提取的RNA为模板，使用HiScript II One Step RT-PCR Kit（Dye Plus）试剂盒直接扩增出Btku80 cDNA序列。

1.2.2 敲除载体pDH-85H3构建挑取部分三孢布拉霉野生型菌丝接种于种子培养基中，25℃、180 r/min培养48 h，液氮研磨后按照基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，以85-F和85-R为引物扩增ku80基因的5′同源臂，以83-F和83-R为引物扩增ku80基因的3′同源臂。以质粒pCSN44为模板，以8H-F和8HR为引物扩增编码HygR（潮霉素抗性基因）的DNA片段。以上3个片段均使用高保真酶PrimerSTAR Max酶扩增，并通过重叠延伸PCR技术连接起来，得到敲除片段85H3，随后通过SmaⅠ、XhoⅠ双酶切连接至双元载体pDHt-sk，得到敲除载体pDH-85H3。敲除原理见图1，敲除载体具体构建过程见图2。

图1 Btku80基因敲除原理示意Fig.1 Gene replacement strategy of Btku80

图2 敲除质粒pDH-85H3构建示意Fig.2 Construction procedure of knock-out vector p DH-85H3

1.2.3 敲除载体转化根癌农杆菌LBA4404制备根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，方法如Jyothishwaran等[16]所述。取根癌农杆菌感受态细胞100μL，加1.5μL质粒，冰浴30 min；放入液氮中速冻1 min，37℃温浴5 min，冰浴3 min；加入LB液体培养基300μL，200 r/min、28℃摇床培养3.5 h；随后4℃、8 000 r/min离心10 min，吸除上清液200 μL，剩下的轻轻吹吸混匀，涂于LB（含卡那霉素50 μg/mL）培养基上，28℃培养3 d。待平板上出现单菌落后，取单菌落接入50 mL LB液体培养基（含卡那霉素50μg/mL）中，200 r/min、28℃摇床培养过夜，提取质粒，进行PCR检测。

1.2.4 三孢布拉霉原生质体的制备将在种子培养基培养2 d的菌丝体8 000 r/min离心10 min，去上清液，使用灭菌称量勺尽量刮取上层培养基，并用灭菌水洗2次菌丝体，然后每克菌丝体加入5 mL复合酶液，置于摇床上，28℃、75 r/min避光酶解4 h。其中复合酶液组成为：2 g/dL溶壁酶、3 g/dL纤维素酶、3 g/dL蜗牛酶，用稳渗液0.6 mol/L NaCl溶解；pH 6.0。酶解获得足够多的三孢布拉霉原生质体后，使用4层灭菌擦镜纸过滤菌丝体，4℃、4 000 r/min离心10 min，去上清液并用稳渗液重悬，得到三孢布拉霉原生质体悬浮液，计数并将原生质体细胞浓度稀释到106个/mL备用。

1.2.5 根癌农杆菌介导三孢布拉霉原生质体转化将根癌农杆菌LBA4404接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，28℃、180 r/min培养至OD600nm≈0.6备用。取根癌农杆菌200μL和三孢布拉霉原生质体200μL混合，加入终浓度为200 mmol/L的AS诱导，置于25℃、180 r/min共同培养2 d，再加入麦汁液体培养基过夜活化后，涂布于含有40μg/mL潮霉素B和150μg/mL头孢噻肟钠的麦汁培养基中，待长出单菌落后进行PCR验证。

1.2.6 三孢布拉霉转化子的鉴定采用碱裂解法[17]快速提取三孢布拉霉基因组。挑取少量菌丝体于80μL 0.5 mol/L氢氧化钠溶液中浸泡15 s，随后加入160μL 0.1 mol/L Tris-HCI中和混匀，取1μL上清液做模板。以快速提取的基因组为模板，使用引物对Ku80-F和Ku80-R、引物对8H1-F和8H1-R（或8H2-F和8H2-R）进行PCR扩增验证，根据扩增片段的大小以及测序结果确定ku80基因是否被敲除。

2 结果与分析

2.1 三孢布拉霉ku80基因的克隆

经NCBI tblast比对，在野生型三孢布拉霉基因组中搜索到了与瓜笄霉ku80蛋白质序列相近的Btku80序列。提取基因组，以Ku80-F和Ku80-R为引物扩增Btku80基因全长。提取总RNA，经逆转录反应及PCR扩增，测序得到Btku80的CDS序列。得到的Btku80基因全长2 716 bp，CDS区2 202 bp，编码732个氨基酸；保守域有3个，分别为vWFA、KU80、Ku-PK-bind domains。

2.2 敲除载体pDH-85H3的验证

敲除载体pDH-85H3经SmaⅠ在30℃酶切2 h后，加入XhoⅠ，37℃再次酶切2 h，随后进行核酸电泳，结果如图3。结果显示敲除载体pDH-85H3经SmaⅠ和XhoⅠ双酶切后，出现了大小分别约为7 400 bp和4 400 bp的两个片段，分别与质粒pDHtsk线性化大小、敲除片段大小一致，初步证明敲除载体pDH-85H3构建成功。

图3 敲除载体pDH-85H3经双酶切后的电泳图Fig.3 Identification of knock-outvector pDH-85H3 digested by SmaⅠand XhoⅠ

2.3 含敲除载体的根癌农杆菌阳性克隆子的鉴定

采用化学转化法将敲除载体pDH-85H3导入根癌农杆菌LBA4404，28℃培养，挑取单菌落提取质粒，使用引物8H-F和8H-R进行PCR扩增HygR基因并经电泳验证，结果见图4。由图4可见，2～7号转化子均得到片段大小约为1 400 bp的扩增产物，与HygR片段预期大小一致，且测序正确，说明敲除载体pDH-85H3已成功转化进根癌农杆菌LBA4404中。

图4 提取根癌农杆菌LBA4404中重组敲除载体pDH-85H3对其PCR产物的电泳分析Fig.4 Analysis of PCR products of recombinant vector pDH-85H3 extracted from Agrobacterium tumefaciens LBA4404

2.4 潮霉素B与头孢噻肟钠筛选压力的选择

野生型三孢布拉霉原生质体在含有潮霉素B质量浓度为0～100μg/mL的高渗再生培养基上培养，发现潮霉素B质量浓度达到40μg/mL时，野生型三孢布拉霉不能生长，因此以40μg/mL潮霉素B作为三孢布拉霉转化子的筛选压力。

根癌农杆菌LBA4404在含有质量浓度为0～200 μg/mL头孢噻肟钠的LB固体培养基上培养2 d后，发现头孢噻肟钠质量浓度达到150μg/mL时，根癌农杆菌完全不能生长，而三孢布拉霉生长不受头孢噻肟钠影响，因此筛选培养基中加入终质量浓度为150μg/mL的头孢噻肟钠来抑制根癌农杆菌生长。

2.5 三孢布拉霉转化子的鉴定

受侵染的原生质体经活化后，涂布于含有40 μg/mL潮霉素B和150μg/mL头孢噻肟钠的麦汁培养基。头孢噻肟钠可以抑制根癌农杆菌在培养基上的生长，三孢布拉霉的生长不受影响，而潮霉素B对野生型三孢布拉霉有抑制作用，对于具有潮霉素抗性的转化子的生长则无影响。经过潮霉素初筛，得到20个三孢布拉霉转化子，结果见图5（a）。为进一步确定潮霉素抗性基因是否插入且替换了ku80基因，对这20株转化子进行PCR验证，并对PCR产物进行sanger测序验证。第一轮验证转化子中是否含有ku80基因，使用引物Ku80-F和Ku80-R进行扩增，扩增得到的ku80片段存在于野生型三孢布拉霉中，不存在于转化子中，结果见图5（b）。

第二轮验证敲除片段。8H1-F和8H1-R引物扩增5′同源臂下部分和HygR基因上部分，得到8H1片段，大小约为1 180 bp，8H2-F和8H2-R引物扩增3′同源臂上部分和HygR基因下部分，得到8H2片段，大小约为1 800 bp。这两个片段无法在野生菌中扩增得到，而能在转化子扩增得到。20株转化子经PCR扩增和sanger测序验证发现，其中18株含有插入的敲除片段，转化率高达90%，有2个转化子是经过同源重组交换的正确敲除株，敲除率为10%，结果见图5（c）。

图5 三孢布拉霉转化子的鉴定Fig.5 Identification of Blakeslea trispora transformants

3 结 语

对丝状真菌基因功能的研究依赖于遗传转化系统的建立。丝状真菌遗传转化方法有PEG介导的原生质体法、农杆菌介导侵染法、基因枪法、电激法等[18]。原生质体法转化成功的关键在于原生质体的再生，因三孢布拉霉原生质体再生相对困难[6]，再生率小于10%[19]，难以得到转化子[6]。基因枪法的原理是在高压作用下，将表面包被有外源DNA的微小金粒或钨粒，高速射入到受体细胞或组织，从而实现外源基因与受体基因组的整合[18]。黄琼瑶[6]曾利用基因枪法，将融合基因表达载体导入到三孢布拉霉中，但影响其转化成功的因素较多且成本较高[18]。电激法对部分丝状真菌的转化效率较低，应用受到限制[18]，尚未发现成功使用电激法进行三孢布拉霉遗传转化的研究。

相较于以上转化方法，本研究中考虑使用根癌农杆菌转化法，但如果以细胞壁极厚的孢子作为受体，很难侵染成功，因此首次将原生质体作为农杆菌转化的受体，虽过程相对烦琐，但转化率得到了很大提高，可以用于三孢布拉霉遗传转化。

另外，以同源重组（HR）为基础的基因敲除技术是进行基因功能研究的常用方法，但包括三孢布拉霉在内的大多数丝状真菌因非同源末端连接（NHEJ）修复占主导[20-21]，同源重组频率极低，降低了基因敲除的效率，因此有必要对参与NHEJ过程的基因进行破坏，以此促进HR[22]。本研究中发现利用同源重组原理敲除ku80基因，敲除率仅为10%，可见三孢布拉霉同源重组频率较低，将来可以通过进一步研究，以此缺陷株为受体，来提高基因敲除效率[23]。