关节康治疗骨性关节炎的网络药理学机制

彭鑫玉， 张海涛， 葛颖杰， 蔡淼鑫， 辛鹏飞， 王睿，李林鹏， 赖斌， 樊粤光， 庞智晖

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院全国中医髋关节病重点专科，广东广州 510405；3.樊粤光广东省名中医传承工作室，广东广州 510405）

骨性关节炎（osteoarthritis）是一种常见的老年退行性关节病，又称增生性关节炎、退行性关节炎或骨关节病。该病好发于髋、膝、踝等下肢负重关节，病变常常累及关节软骨、软骨下骨、滑膜等组织，最终导致患病关节疼痛、畸形和运动功能障碍，大大降低了患者的生活质量[1-2]。骨性关节炎属于中医学“骨痹”的范畴。《济生方》云：“风寒湿三气杂至，合而为痹，皆因体虚，腠理空虚，受风寒湿气而痹也。”痹证的形成内因是正气不足，外因是风、寒、湿邪的侵入，内虚外感而成痹。关节康为广州中医药大学第一附属医院的院内制剂，是樊粤光教授以补肾活血法为组方依据，集临床近20年的经验研制而成，治疗骨性关节炎疗效确切[3]。关节康由熟地黄、补骨脂、杜仲、枸杞、丹参、川芎、红花、木香、牛膝、木瓜等10味中药组成，具有补肾壮骨、活血化瘀之功效。既往研究表明，关节康通过促进软骨基质的合成，抑制软骨基质的分解进程，可达到促进病变关节软骨修复的目的[4-5]。本研究基于网络药理学构建复方-中药有效成分-靶点基因-骨性关节炎疾病共表达网络，并对交集基因进行富集分析，进一步探讨关节康治疗骨性关节炎的作用机制，以期为其临床应用及后期试验奠定理论基础。现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 关节康活性化合物及其作用靶点预测在中药系统药理学数据库（TCMSP）中，分别检索关节康中熟地黄、杜仲、枸杞、丹参、川芎、红花、木香、牛膝、木瓜9味中药。再依据毒药物动力学参数（ADME），以生物利用度（OB）＞30%、类药性（DL）＞0.18为限定条件，筛选9味中药的有效成分及其作用靶点。因在TCMSP中未能检索出补骨脂，故应用中药分子机制的生物信息学分析工具（BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batmantcm）来预测补骨脂的作用靶点，其通过“药物相似性分数”的原理进行靶点预测，药物相似性分数指利用解剖-治疗-化学的药物分类系统（ATC）、药物的副作用，化合物相互作用计分的相似度，蛋白相互作用网络中心趋向性，功能富集相似度等计算得出各类相似分数，并通过LODO（leave-one-drug-out）法对预测结果进行验证，确保预测更为精确。即：将关节康中药的大写拼音分别输入至TCMSP或BATMAN-TCM数据库中，并将预测靶点基因的条件设置为默认值，得出10味中药的化合物成分及其预测的靶标基因。

1.2 骨性关节炎疾病靶点检索以“osteoarthritis”为检索词，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、在线人类孟德尔遗传（OMIM）（https://omim.org/）2个在线数据库中检索骨性关节炎已知相关疾病靶点，将2个数据库检索出的疾病靶点汇总去重后得到骨性关节炎疾病靶点。

1.3 关节康-骨性关节炎疾病交集靶点基因相互作用网络的构建及核心基因筛选获取关节康相关预测作用靶点和骨性关节炎已知疾病靶点后，用R语言运行脚本取两者靶点基因重叠交集，将交集基因导入STRING在线数据库（http://stringdb.org/）进行蛋白相互作用网络的构建。通过R语言运行脚本分析计算每个靶点基因的邻接基因数目（即靶点基因之间相互作用的连线数目），并采用Excel作条状图以直观显示。

1.4 关节康-靶点-骨性关节炎疾病调控网络构建为了进一步了解关节康治疗骨性关节炎的作用机制，将上述3步得到的“关节康-靶点-骨性关节炎”靶点导入Cytoscape 3.7.2软件（http://www.cytoscape.org）进行关节康治疗骨性关节炎疾病可视化调控网络模型的构建，其结构关系为“关节康-10味中药-有效化合物-靶点-骨性关节炎”。

1.5 基因本体论（GO）分析GO分析是一个在生物信息学领域中广泛运用的系统，它包括生物学的3个方面：细胞组分、分子功能、生物过程。DAVID数据库是一个集生物功能注释、网络可视化和集成发现于一身的多功能生物信息数据库。本研究应用DAVID分析工具（https://david.ncifcrf.gov/）对关节康-骨性关节炎疾病交集靶点基因进行GO富集分析，根据统计学超几何分布定量（P值）评价存在于各GO注释中的蛋白质群，以P值反映蛋白质生物学功能的显著性。将物种与背景设置为“Homo sapiens”（人类），设定P＜0.01，得到关节康治疗骨性关节炎的生物过程、分子功能、细胞组分结果。采用ImageGP在线作图工具（http://www.ehbio.com/ImageGP/）制作GO分析结果气泡图。

1.6 京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析算法原理与GO富集分析相同。应用DAVID工具对关节康-骨性关节炎疾病交集靶点基因进行KEGG通路分析（设定P<0.01），将物种与背景设置为“Homo sapiens”（人类），得到关节康治疗骨性关节炎的主要作用通路，并对其通路进行分析，采用ImageGP在线作图工具制作KEGG通路气泡图。

2 结果

2.1 关节康有效化合物、作用靶点及骨性关节炎疾病靶点的预测结果通过TCMSP和BATMANTCM平台检索总共预测到关节康的有效化合物95个，其中，熟地黄1个，木香3个，木瓜2个，红花14个，枸杞子9个，杜仲20个，丹参52个，川芎4个，川牛膝3个，补骨脂4个，中药之间存在17个共同有效化合物。随后，获得其作用靶点共257个。通过GeneCards和OMIM数据库共筛选获得骨性关节炎疾病靶点共2 868个。取两者靶点的交集，最终获得关节康-骨性关节炎疾病交集靶点共109个。见图1。

图1 关节康和骨性关节炎疾病的交集靶点基因图Figure 1 Venny diagram of intersection targets of Guanjie Kang and osteoarthritis

2.2 关节康-骨性关节炎疾病交集靶点基因相互作用可视化网络及关键基因筛选结果利用STRING在线数据库构建了交集靶点基因蛋白相互作用网络，见图2。蛋白相互作用网络包含38个蛋白质节点，659条相互作用关系，即节点间的连接线。然后从STRING输出string_interactions.tsv，并将其输入Cytoscape 3.7.2软件中，使用“CytoNCA”插件对该蛋白相互作用网络模型做关键靶点筛选，以该网络中的节点度值（Degree）大于平均值，获得关键靶点基因38个。

图2 关节康-骨性关节炎交集基因的蛋白相互作用网络图Figure 2 Protein-protein interaction network of Guanjie Kang-osteoarthritis intersection targets

2.3 关节康-靶点-骨性关节炎疾病可视化调控网络采用Cytoscape 3.7.2软件将关节康-靶点-骨性关节炎疾病绘制可视化调控网络图（见图3），图中清晰可见关节康中10味中药与有效化合物、有效化合物与关键靶点基因、关键靶点基因与骨性关节炎疾病之间分别的对应关系。关键靶点基因所连接的有效化合物越多，表明度值越大，该靶点则更重要。网络中，右边V字四边形38个节点为关键靶点基因，左边三角形95个节点为有效化合物。错综复杂的“边”（连线），代表了关节康中10味中药所含的多种有效化合物通过多条途径作用于靶点基因。

图3 关节康-靶点-骨性关节炎疾病可视化调控网络Figure 3 Visual controlling network of Guanjie Kangtarget-osteoarthritis

2.4 交集基因的GO富集分析结果应用DAVID在线分析工具对关键靶点基因进行分析，将P值设定为（P≤0.01）并按照P值升序排列获得49个功能富集，其中，包括生物过程29个，分子功能10个，细胞组分10个。选取排名前10位的生物过程、分子功能、细胞组分绘成气泡图（见图4），图中气泡颜色越深，气泡越大，则表示功能富集的基因数目越多，该功能富集更为重要。GO富集分析结果显示，关节康-骨性关节炎疾病交集关键基因的生物过程主要是RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、转录的正调控和DNA模板、药物反应、一氧化氮（NO）生物合成过程的正调控、细胞对脂多糖的反应、凋亡过程负调控、血管生成、基因表达的正调控、序列特异性DNA结合转录因子活性的正调控、细胞增殖的正调控等；分子功能为转录因子结合、蛋白磷酸酶结合、相同的蛋白结合、酶结合、生长因子活性、细胞因子活性、蛋白结合、转录调节区DNA结合、转录激活活性-RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端区序列特异性结合、蛋白质异二聚活性等；细胞组分为细胞外空间、细胞外区域、胞质、血小板-阿尔法颗粒管腔、转录因子复合物、细胞核、质膜外侧面、质膜穴样内陷、核浆、受体复合体等。

图4 关节康-骨性关节炎疾病交集基因的GO富集分析结果Figure 4 Go enrichment analysis results of Guanjie Kang-osteoarthritis intersection targets

2.5 关键基因的KEGG富集分析结果关节康-骨性关节炎疾病交集的关键靶基因的KEGG富集分析结果主要涉及癌症通路、南美锥虫病（美洲锥虫病）、TNF信号通路、缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路、膀胱癌、百日咳、乙型肝炎、利什曼病、沙门氏菌感染、癌症中的蛋白多糖等信号通路。见图5。

图5 关节康-骨性关节炎疾病交集的关键靶基因的KEGG富集分析结果Figure 5 KEGG enrichment analysis results of key Guanjie Kang-osteoarthritis intersection targets

3 讨论

本研究借助网络药理学手段，初步挖掘、分析关节康治疗骨性关节炎的可能作用机制，并针对目前相关性较强且文献研究较充足的通路进行分析讨论。通过GO富集分析显示，关节康主要通过RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、NO生物合成过程的正调控、细胞对脂多糖的反应、血管生成等作用于骨性关节炎疾病。生物过程中RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控的显著性居于首位。目前研究发现在骨性关节炎患者的关节液和组织中观察到炎症反应，并且炎症机制被认为是促进骨性关节炎进展的危险因素[6]，而RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控与炎症机制密切相关。脂多糖又称内毒素，通过激活Toll样受体4，引发一系列信号级联反应，进而激活NF-κB，从而启动一系列免疫相关基因[7-8]，导致炎性细胞浸润，诱发或加重炎症反应[9]。故推测关节康可能通过RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控和细胞对脂多糖的反应来控制炎症进而达到治疗骨性关节炎的目的。

骨性关节炎的主要病理改变为关节软骨的进行性丢失和破坏[10-11]，软骨损伤时会分泌蛋白来修复受损的细胞外基质，该过程可导致软骨的内环境平衡改变，促进细胞因子分泌，影响凋亡通路，引起软骨细胞凋亡发生[12]。受损的软骨细胞产生一种介导软骨细胞双重作用的多功能分子一氧化氮（NO）[13]，NO可以保护培养的软骨细胞免受氧化应激损伤，但NO升高可以抑制软骨细胞中白细胞介素1受体拮抗剂（IL-1RA）的合成，而软骨细胞产生的IL-1RA可有效抑制软骨的损伤与破坏，故NO升高异常是骨性关节炎发生的危险因素之一[14]。骨性关节炎关节的血管生成与炎性反应相互影响[15]。骨性关节炎伴有滑膜炎症，且病理特征为巨噬细胞浸润，该细胞可分泌血管内皮生长因子（VEGF）[16]，VEGF可促进血管生成，有研究发现小鼠关节腔注射VEGF可诱发骨性关节炎[17]。软骨细胞肥大（软骨细胞表型发生改变）和软骨内血管生成存在相互依存关系[18]，骨性关节炎患者软骨内血管生成可能诱发软骨内成骨，进而引起关节软骨细胞外基质矿化[19]。因此，关节康可能通过作用于NO生物合成过程的正调控和血管生产等来调控关节软骨生产、凋亡、钙化等而达到治疗骨性关节炎的目的，具体机制还需进一步研究。

通过KEGG富集分析，关节康主要通过癌症通路、南美锥虫病（美洲锥虫病）、TNF信号通路、HIF-1信号通路、膀胱癌、百日咳、乙型肝炎、利什曼病、沙门氏菌感染、癌症中的蛋白多糖等作用于骨性关节炎疾病。其中肿瘤通路的显著性最高，目前有研究显示，在骨性关节炎患者滑膜组织中发现了肿瘤信号通路的高调控，说明骨性关节炎滑膜组织具有肿瘤样特性，因此肿瘤通路可能为骨性关节炎治疗和诊断的潜在靶点基因[20]。本研究结果显示，膀胱癌和癌症中的蛋白多糖与骨性关节炎密切相关，则是对上述观点的再次验证。目前发现，TNF-α在骨性关节炎发生、发展中起重要作用[21]，TNF-α在骨性关节炎患者血浆及关节液中的含量明显高于正常人，并且TNF-α在关节内的含量与骨性关节炎病变程度密切相关[22]。TNF-α在骨性关节炎中过度表达可导致滑膜增生肥厚，并引起关节软骨的内环境改变，加重骨性关节炎退化。因此，抑制TNF-α在滑膜中的表达，有利于降低骨性关节炎的发病率，减轻病变程度[23]。因关节软骨中无血管，这限制了氧从滑液和软骨下骨到软骨细胞的扩散[24]。HIF-1由2个不同的亚基HIF-1α和HIF-1β组成，HIF-1α对软骨细胞的存活具有重要作用[25]，HIF-2α是自噬通量的有效负调节因子[26]，对骨性关节炎起着整体有害作用，HIF-2α介导软骨破坏以及软骨细胞死亡，均促进骨性关节炎病程的发展[27]。目前，尚未发现骨性关节炎与南美锥虫病（美洲锥虫病）、百日咳、乙型肝炎、利什曼病、沙门氏菌感染等感染性疾病有直接联系。因此，推测关节康可能通过调控TNF和HIF-1来达到治疗骨性关节炎的目的。

综上所述，本研究基于网络药理学分析关节康治疗骨性关节炎的作用机制，发现关节康可能是通过癌症通路、TNF、HIF-1、NO生物合成过程的正调控、血管生成、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控和细胞对脂多糖的反应等来治疗骨性关节炎，但还需要进一步的实验研究加以验证。关节康治疗骨性关节炎是多靶点、多通路、多选择的复杂机制过程，是中医药防治疾病的整体观念和辨证论治指导思想的有效印证，为进一步理解关节康治疗骨性关节炎的作用机制提供了重要的线索，更为中医药治疗骨性关节炎提供了新的研究思路。本研究的局限性在于仅对关节康治疗骨性关节炎的作用机制进行了预测，具体机制尚待进一步研究证实。