基于稳定同位素比值的阳春砂产地判别分析

钟慧怡， 黄海波， 陈玉娥， 覃挺红

（广州中医药大学中药学院，广东广州 510006）

阳春砂为姜科植物Amomum villosumLour.的干燥成熟果实，味辛、性温，归脾、胃、肾经，具有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎等功效，临床上多用于湿浊中阻、脘痞不饥、脾胃虚寒等证[1]，是治疗胃肠疾病的常用药，为“香砂六君丸”“香砂理中丸”等著名中成药的组方原料[2]。阳春砂主要产于广东省阳春市，近年来产区逐渐由阳春及其周边变迁到广西南宁、百色、崇左及云南西双版纳、红河等地。由于引种产地具有适宜的环境气候和较为成熟的种植技术，阳春砂得到了大规模的种植。但不同产地的阳春砂在化学成分和药理作用上有所差别（道地产地的质量较优），且其市场价格差距较大，以次充好的现象时常发生，造成了阳春砂商品来源复杂混乱的现状[3]，因此，为保护药材道地性、提升消费者信心，有必要对阳春砂进行产地溯源。目前，常用的溯源技术主要有高效液相色谱法、气相色谱法以及稳定同位素比质谱法等，其中，稳定同位素比质谱法是近年来逐步发展的一种新型溯源技术，广泛应用于各行各业如中药材[4-7]、稻米[8]、茶叶[9]、果蔬类[10-11]等的产地溯源，具有无污染、高精密度、高准确度等优点。既往有研究发现：不同产地何首乌的稳定同位素比值具有明显的地域分布特征，结合化学计量学方法可有效对何首乌进行产地溯源[5]；利用碳、氮稳定同位素对青海、云南、四川以及尼泊尔等12个产地的冬虫夏草样品进行产地区分，结果发现不同地区的样品之间δ15N差异较大，可以利用δ15N比值对大多数样品的产地来源进行有效的区分[7]；不同产地的茶叶中稳定同位素δ15N、δ13C、δD和δ18O的数值范围也不同，表现出一定的地域特征[9]。本研究采用稳定同位素比质谱法检测，结合正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）与线性判别分析方法（LDA）建立阳春砂产地判别模型，初步对广东、广西及云南产的阳春砂进行产地溯源和判别，探讨用于阳春砂产地溯源和地理标志产品保护的可行性，以期为阳春砂的道地性保护提供借鉴和技术支持。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料阳春砂样品主要采集于广东、广西和云南3省，购于当地药农，由广州中医药大学中药学院黄海波副教授鉴定为姜科植物阳春砂（AmomumvillosumLour.），总样品量为39个。收集的干果用密封袋封装，置于4℃冰箱冷藏保存。样品产地信息见表1、图1。

图1 阳春砂样品采集地点Figure 1 The locations of collecting Amomum villosum samples

表1 阳春砂样品产地信息表Table 1 The information of Amomum villosum habitats

1.2 阳春砂样品的测定

1.2.1 碳、氮稳定同位素比值的测定称取5 g制备好的样品包入锡囊，排尽空气，放入元素分析仪的固体进样器依次进样。样品在高温的过氧环境下瞬间燃烧，燃烧产生的气体被氦载气流带入并通过氧化还原反应管，气体在高纯氦气的运载下经还原转化成CO2（N2），随后气体通过色谱柱将CO2和N2气体分开后进入质谱仪的离子源进行电离，形成的离子束经磁分析器将不同质荷比的离子完全分离，最后进入到检测器进行分析和测定。测定结果用单点校正法计算。

元素分析仪测定：氧化炉温度1 020℃，还原炉温度680℃，载气流速90～100 mL·min-1，注氧时间3 s，吹扫流量180 mL·min-1。

1.2.2 氢稳定同位素比值的测定称取适量的样品于锡杯中并将其放置于90℃的烘箱内干燥12 h，以去除样品表面的吸附。再将烘烤后的样品置于高温裂解炉中进行裂解反应，矿物包体水、含羟基的单矿物或有机物在裂解释放后与玻璃碳瞬间反应生成H2，被高纯氦气携载经过色谱柱进入同位素质谱仪，测定H2的同位素比值δD。测定结果用单点校正法计算。

元素分析仪测定：炉温1 380℃，载气流速150 mL·min-1，吹扫流量200 mL·min-1。色谱柱温50℃。

2 测定结果与数据分析

2.1 计算方法与数据处理重同位素丰度与轻同位素丰度之比用同位素比值R表示，样品R值与国家标准物R值的比较用δ来表示，即δ13C、δ15N、δD，用该值代表样品的同位素比值，计算公式：δ（‰）=（R样品/R标准-1）×1 000。

应用SPSS23.0统计软件对不同产地的阳春砂样品3种稳定同位素比值进行差异分析及线性判别分析。利用SIMCA-P Version 14.1软件（瑞典Umetrics AB公司）进行正交偏最小二乘法判别分析。

2.2 阳春砂C、N、H稳定同位素比值差异分析阳春砂样品中δ13C、δ15N及δD的含量测定结果见表2，利用K-W检验不同组间的同位素比值是否有差异。从表3得知，不同省份之间的δ13C和δD有显著性差异（P＜0.01），表明3个省份阳春砂的同位素比值有差异，能够为后续产地判别的可行性提供依据。所测得的39份阳春砂中的δ13C值在-31.41‰～-25.44‰之间，根据均值大小排列依次是云南＞广东＞广西；3个省份的δ15N值在-2.61‰～2.93‰之间，按大小排列依次是云南＞广西＞广东。其比值相差不大，说明不同省份阳春砂的生长环境及施肥方式等因素不足以造成氮同位素比值的显著性差异。降水影响着氢同位素的组成，距海越近，雨水及地下水中D含量越大。所测得的样品δD值在-68.76‰～-45.64‰之间，不同省份之间δD值差异较大，按大小排列依次是广东＞广西＞云南。

表2 阳春砂样品C、N、H稳定同位素测定结果Table 2 Determination results of C，N，H stable isotopes of Amomum villosum

表3 K-W检验统计Table 3 Statistical results of K-W test

进一步选取样品数较多、具有地域代表性的产地进行分组，分别是广东阳春、广西崇左、云南西双版纳、云南文山这4个产地样品的δ13C、δ15N、δD比值进行差异分析。4个代表产区的阳春砂δ13C值介于-31.35‰～-25.94‰之间，崇左相对贫化，文山相对富集。δ15N值介于-1.02‰～2.93‰之间，崇左相对贫化，西双版纳相对富集。δD值则介于-68.76‰～-45.64‰之间，西双版纳相对贫化，阳春相对富集。具体结果见表4~5。

表4 3个省份阳春砂样品C、N、H稳定同位素描述统计表Table 4 Description of statistics of C，N，H stable isotopes of Amomum villosum from 3 provinces

2.3 正交偏最小二乘法判别分析观察表2~5数据，可以发现3个省份的阳春砂样品中δ13C、δ15N、δD的含量比值存在一定的差异。为了使分析结果更加直观可靠，且具有统计学意义，采用有监督性分析OPLS-DA，可减少组内差异，筛选造成分类的差异变量。为了帮助选择贡献较大的差异组分，变量权重重要性排序（variable importancein projection，VIP）值被作为多维模型差异元素选择的指标[12]。VIP值越大，该成分在不同省份的阳春砂样品中的差异越显著。按照经验值，VIP值大于1的组分即为多维模型的贡献变量，其中，VIP值大于1.5的组分可被标记为非常显著的贡献变量。

将样品按省份分为广东、广西和云南3组，利用δ13C、δ15N、δD这3个同位素比值进行正交偏最小二乘法判别分析，OPLS-DA得分见图2。广东与云南的样品得到较好的分离，但广西有部分样品与广东、云南均有重叠，不能较好地分离。3个省份样品的同位素VIP值见表6，VIP值大于1的组分共2种，δD、δ13C为贡献变量，其中δD标记为非常显著的贡献变量，说明这2个同位素在样品分类中起着关键作用。

图2 广东、广西、云南阳春砂样品的同位素OPLS-DA得分图Figure 2 OPLS-DA scores of Amomum villosum from Guangdong，Guangxi and Yunnan

表5 4个代表产区的阳春砂样品C、N、H稳定同位素描述统计表Table 5 Description of statistics of C，N，H stable isotopes of Amomum villosum from 4 representative habitats

再选取广东阳春、广西崇左、云南西双版纳、云南文山这4个产地样品的δ13C、δ15N、δD比值进行OPLS-DA分析，得分见图3。由图可知：文山的样品得到较好的分离，样品间的距离小；阳春的样品也基本得到分离，但各样品间的距离较大；而崇左和西双版纳的分离效果较差，崇左的部分样品落在阳春和西双版纳的范围内，西双版纳的样品分布位置较散，有部分样品与文山归为一类。4个产地样品的同位素VIP值见表6，贡献变量同样为δD、δ13C，且均被标记为极显著的贡献变量。

表6 阳春砂样品的同位素VIP值Table 6 The VIP values of Amomum villosum samples

图3 阳春、崇左、西双版纳、文山阳春砂样品的同位素OPLS-DA得分图Figure 3 OPLS-DA scores of Amomum villosum from Yangchun，Chongzuo，Xishuangbanna and Wenshan

2.4 基于线性判别分析方法的阳春砂产地区分模型通过OPLS-DA筛选出具有显著差异性的同位素δ13C、δD，利用这2个同位素比值进行线性判别分析，判别结果显示产地回判的正确率有76.9%，分类结果见表7。有30.0%的广东样品被错误地归类到广西，16.6%的广西样品也被误归到广东。由于云南的地理位置与广东差距较大，两省份的样品无相互错判的情况，分类效果较好。但云南与广西位置相邻，有11.8%的云南样品被错误归类到广西，16.7%的广西样品也被错误归类到云南。再针对广东阳春、广西崇左、云南西双版纳、云南文山这4个产地进行判别，回判正确率89.7%，说明此模型比较适于阳春砂产地溯源。分类结果见表8。

表7 广东、广西、云南3个省份阳春砂样品稳定同位素判别结果Table 7 Discrimination results of the stable isotopes of Amomum villosum from Guangdong，Guangxi and Yunnan

表8 阳春、崇左、西双版纳、文山4个产地阳春砂样品稳定同位素判别结果Table 8 Discrimination results of stable isotopes of Amomum villosum from Yangchun，Chongzuo，Xishuangbanna and Wenshan

3 讨论

由于不同地域的气候、降水、地质、土壤以及人为等因素的不同，导致生长在地理位置差距大的同种植物的同位素丰度出现一定的差异。植物体内对氮素的固化、同化、吸收和排除过程影响着氮同位素的分馏作用。因此，植物的生长环境和施肥方式等都可能导致氮同位素比值的变化，尤其是施肥方式对氮素的影响较为显著[13-15]。但不同产地阳春砂δ15N的变化范围较小，其比值相差不大，地域特征不明显。说明不同省份阳春砂的生长环境及施肥方式等因素不足以造成氮同位素比值的显著性差异。而δD、δ13C的变化范围较大，有一定的差异性和地域特征（P＜0.01）。植物体内C同位素的组成主要与其固定CO2的方式，即光合作用途径（C3、C4、CAM）有关，同一物种固定CO2的方式相同且13C在固定范围内，但气温、降水及大气中CO2浓度等影响因素可能会造成δ13C比值的差异，通常与13C呈负相关关系[15]。观察表4、5数据，根据δ13C均值大小排列依次是云南＞广东＞广西，其中，广西崇左相对贫化，云南文山相对富集，可能与云南阳春砂生长环境中的气温、降水量低于其他2个省份的原因有关。云南各产地的气温在16.3～20.5℃之间，广东与广西的气温较接近，均在21.2～22.6℃范围内。云南的年平均降水量为779.0～2 026.5 mm，广西为1 000.0～1304.2 mm，而广东的降水量相对较高，在1 650.0～2 116.0 mm之间。降水也影响着氢同位素的组成，通常为正相关关系，距海越近，雨水及地下水中D含量越大。广东南临南海，广西南临北部湾，故广东的δD远高于云南，其中阳春相对富集，西双版纳相对贫化；而广西介于二者之间，δD值介于-68.76‰～-45.64‰之间。

在建立判别模型时，自变量的个数多并不代表结果更好，若未加选择地使用全变量进行分析，可能会产生较大的偏差。因此，本研究采用OPLS-DA对不同产地的阳春砂样品进行初步判别，筛选出具有显著差异性的同位素，再利用经筛选后的差异性指标建立LDA判别模型，减少出现判别结果的偏差，提高判别效果及可信度。利用δ13C、δD的比值建立广东、广西、云南等3个省份的产地判别模型，判别率仅为76.9%，产地判别的正确率不高。可能因为这3个省份的自然气候和生态环境相似，不足以导致同位素比率的显著性变化，所以，有部分样品被误判到邻近的省份。进一步选取广东阳春、广西崇左、云南西双版纳、云南文山这4个样品数较多且具有地域代表性的产地样品进行判别分析，所得判别率达到89.7%，说明这4个产地的判别模型良好，具有一定的可行性，但后续仍需要结合更多其他指标作进一步判别分析，提高模型的准确性。

利用稳定同位素比值建立的判别模型，正确率不高的可能性有：分析的指标少，获得的同位素信息面不全；所采集的样品其地理位置差距不大，导致同位素比值的差异不足以准确地区分不同产地的阳春砂；样本量有限，无法反映整体的差异性。因此，需要结合更多的分析指标如无机元素、有机成分等指标，以及增加地理位置差距大的样品数量来提高判别正确率，才可为阳春砂的产地鉴别提供更多的科学依据，以进一步证明该方法的可行性。

综上所述，稳定同位素比质谱法作为一种新型的检测技术，结合多元统计方法可为中药材的产地鉴别提供一种新的思路。结合OPLS-DA及LDA方法建立不同产地阳春砂的判别模型，分析结果表明广东阳春、广西崇左、云南西双版纳、云南文山这4个产地的判别模型良好，具有地域性特征的δ13C、δD有望被应用于阳春砂产地溯源。