竹菌的天然抗氧化活性初探

程依婷 范集壮 张朝志 佘 容* 杨晓燕

（1大理大学天然抗氧化剂和抗氧化炎症研究院，云南大理671003；2中国三江并流区域生物多样性协同创新中心，云南大理671003；3大理大学三江并流区域生物多样性保护与利用云南省创新团队，云南大理671003；4大理大学东喜玛拉雅研究院，云南大理671003）

氧化应激是指在体内外有害因素刺激下，体内自由基增加或机体抗氧化保护能力减弱，导致氧化系统和抗氧化系统失衡[1]。人体的新陈代谢本身就是一个氧化过程，机体自身的老化过程、炎症的发生以及环境污染、紫外线、农药残留、汽车尾气、微波等外界刺激都会导致人体产生过多的自由基。自由基过多会破坏细胞结构，导致代谢异常[2]。研究表明，癌症、衰老和部分其他疾病的产生都与过量自由基有一定的关联，甚至被认为是引起突变、诱发癌症的重要原因[3]。许多疾病如心脑血管疾病、免疫反应疾病等，也主要是由于人体内过量的自由基引发氧化应激，从而造成细胞损伤。因此，维持体内适当的氧化还原平衡，对人体健康尤为重要[4-5]。抗氧化剂能通过清除自由基降低人体内化合物氧化速率，从而达到保护机体的作用[6]，而大型真菌中有许多种类都具有显著的抗氧化活性[7-8]，其开发利用正是当前天然产物研究的热点。

竹菌Engleromycis goetzii，又名肉球菌，是子囊菌纲、肉座菌科、肉球菌属的一种真菌，是云南、四川、西藏等地具有悠久历史的民族药。竹菌具有抗菌消炎作用，目前正广泛用于治疗喉炎、扁桃体炎、胃溃疡和急性肾炎等[8-9]。但关于竹菌化学成分的研究报道很少，其治疗作用机理也尚不明确，仅有推测其可能是与自由基清除有关。因此，笔者以竹菌为研究对象，通过DPPH、ABTS和FRAP 3种方法测定其石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇及蒸馏水提取物的抗氧化活性，评估竹菌天然抗氧化潜能，为其药物开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

竹菌采摘于云南云岭拉沙山自然保护区。

图1 竹菌

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

SCIENTZ-10N冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司），RE-2000A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），LG10-2.4A高速离心机（北京医用离心机厂），722N可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司），PX224ZH电子天平（奥豪斯仪器有限公司）。

1.2.2 试剂

1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH，分析纯，梯希爱化成工业发展有限公司），2，2-联氮-双（3-乙基苯井噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS，分析纯，上海麦克林生化科技有限公司），2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ，分析纯，上海麦克林生化科技有限公司），抗坏血酸（VC）、无水乙酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），乙酸乙酯（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司），冰醋酸（分析纯，广东省化学试剂工程技术研发开发中心），石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、无水乙醇、95%乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）等。

1.3 试验方法

1.3.1 竹菌提取物制备

将晒干的竹菌粉碎，过孔径180um筛。准确称取竹菌粉50 g入500 mL锥形瓶，按料液比1∶10加入石油醚500 mL，20℃、60%功率、40 Hz超声浸提1 h，避光静置24 h后，用移液吸出上清，抽滤，滤液经旋转蒸发浓缩，并经冷冻干燥后即为石油醚提取物，4℃保存备用[10]；沉淀于40℃烘干后再依次加入乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇和蒸馏水，重复上述过程。最终分别获得石油醚提取物（EPEE）、乙酸乙酯提取物（EEAE）、正丁醇提取物（ENE）、95%乙醇提取物（EAE）和蒸馏水提取物（EDWE）。

1.3.2 DPPH自由基清除率测定

DPPH自由基清除率标准曲线的制作：量取1 g/L的DPPH母液60 mL，用乙醇定容至50 mg/L以作工作液，置于冰箱中避光保存备用。使用时，用乙醇稀释至0μg/L，5×103μg/L，10×103μg/L，15×103μg/L，20×103μg/L，25×103μg/L，并在517 nm波长处测定各质量浓度DPPH溶液吸光度，以样品质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制DPPH自由基标准曲线[11-13]。

样本DPPH自由基清除率测定：准确称取提取物干粉，并以甲醇（或水）为溶剂，配制成不同质量浓度（15 g/L，10 g/L，5 g/L，2.5 g/L，1.25 g/L，0.625 g/L）的样品作为试验组，分别取2 mL样品，1∶1加入50 mg/L DPPH工作液，同时以甲醇作为空白对照，VC作为阳性对照。每个质量浓度设置6个重复，1个对照，1个空白试验。将混合液摇匀，37℃避光水浴30 min后，于517 nm处测定其吸光度值，计算样本自由基清除率及其半抑制量（IC50）[14]。

1.3.3 ABTS自由基清除率测定

将7 mmol/L的ABTS储备液和2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液按照1∶1（V/V，mL）混匀，25℃避光反应12～16 h，得ABTS自由基母液。用无水乙醇稀释ABTS自由基母液40倍得ABTS工作液，使其在734 nm处的吸光值为0.70±0.02[15-17]。

准确称取提取物干粉用甲醇（或水）为溶剂，配制成不同质量浓度（15 g/L，10 g/L，5 g/L，2.5 g/L，1.25 g/L，0.625 g/L）的样品液作为试验组，分别取2 mL样液，1∶1加入ABTS工作液，并以甲醇作为空白对照，VC作为阳性对照。每个质量浓度设置6个重复，1个对照，1个空白试验。将混合液摇匀，避光反应6 min，立即在734 nm处测定溶液的吸光度值，计算其自由基清除率，并以样品质量浓度为横坐标，ABTS自由基清除率为纵坐标绘制曲线图。

1.3.4 FRAP总氧化还原能力测定

0.3 mol/L pH 3.6醋酸缓冲液配制：称取0.32 g无水醋酸钠加入3.36 mL冰乙酸中并用蒸馏水定容至200 mL，用1 mol/L HCl溶液调节pH至3.6。10 mmol/L TPTZ溶液配制：称取0.078 g TPTZ用40 mmol/L HCl溶液定容至25 mL。20 mmol/L FeCl3配制：称取0.2 705 g FeCl3·6H2O用蒸馏水定容至50 mL。将以上溶液以10∶1∶1的比例混合即为FRAP总抗氧化能力测定工作液，所有溶剂需现配现用[18-19]。

标准曲线绘制：用去离子水配制FeSO4溶液（浓度为0.1 mmol/L，0.2 mmol/L，0.4 mmol/L，0.8 mmol/L，1.6 mmol/L），按照上述方法测定标准溶液的吸光度，再以吸光度为纵坐标，FeSO4浓度为横坐标绘制标准曲线。

样本总氧化还原能力测定：准确称取提取物干粉，用甲醇（或水）为溶剂，配制成不同质量浓度（15 g/L，10 g/L，5 g/L，2.5 g/L，1.25 g/L，0.625 g/L）的样品液。检测时，先在反应管中加入150μL样品液，再加入3.6 mL工作液，混匀后于37℃条件下水浴10 min。每个质量浓度设置6个重复。试验同时以去离子水为空白对照，VC为阳性对照，水浴后于593 nm处测定反应液吸光度。

1.4 数据分析

DPPH/ABTS自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%

式中：Ai为样液+DPPH/ABTS工作液的吸光度；Aj为样液+无水甲醇的吸光度；Ac为DPPH/ABTS工作液+无水甲醇的吸光度[15]。

IC50计算：根据竹菌提取物DPPH/ABTS自由基清除率与浓度曲线所得回归方程，计算得到竹菌提取物将自由基原始质量浓度减少至50%时的使用浓度。

比活性计算：A（%）=A1/A2

其中A表示比活性，A1表示VC的IC50，A2表示样品的IC50。比活性越大，表明其抗氧化活性越强。

样本总氧化还原能力计算：以1 mmol/L的FeSO4的吸光值为标准吸光值，当样品抗氧化活性达到同样吸光值时为一个FRAP值[20]。FRAP值计算：FRAP（mmd）=（Ai-Aj）/A0

其中，Ai为样本吸光值；Aj为对照吸光值；A0为标准吸光值。

2 结果与分析

2.1 DPPH自由基清除能力

对DPPH溶液质量浓度（C）和吸光度（A）做线性回归，拟合变化趋势。其线性回归方程为y=0.008 5x+0.001 4，R2=0.999 7。

竹菌的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇及蒸馏水提取物均具有DPPH自由基清除能力，且随着样品质量浓度的升高，自由基清除能力先上升，后趋于平稳状态。但不同溶剂提取物的清除能力存在差异：在提取剂质量浓度为0.625～15 g/L时，蒸馏水提取物的清除效果最好（IC50=1.297，比活性为0.463%），其次是乙酸乙酯提取物（IC50=2.948，比活性为0.204%），再次是95%乙醇提取物（IC50=5.848，比活性为0.103%）和正丁醇提取物（IC50=8.836，比活性为0.068%），效果最差的是石油醚提取物（IC50=25.491，比活性为0.024%）。其中，比活性最大的为最小的19.292倍（表1）（图2）。

表1 不同溶剂提取物自由基清除能力

图2 竹菌不同溶剂提取物的DPPH自由基清除率

2.2 ABTS自由基清除能力

竹菌的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇及蒸馏水提取物均具有清除ABTS自由基清除能力，且随着样品质量浓度的升高，自由基清除能力先上升，后趋于平稳状态。但不同溶剂提取物的清除效果也存在差异：在提取剂质量浓度为0.625～15 g/L时，95%乙醇提取物的清除效果最好（IC50=0.378，比活性为0.793%），其次是蒸馏水提取物（IC50=0.546，比活性为0.549%），再次是乙酸乙酯提取物（IC50=0.710，比活性为0.423%）和正丁醇提取物（IC50=1.149，比活性为0.261%），效果最差的是石油醚提取物（IC50=4.289，比活性为0.070%）。其中，比活性最大的为最小的11.329倍（表1）（图3）。

图3 竹菌不同提取物的ABTS自由基清除能力

2.3 总氧化还原能力

以吸光度为纵坐标，FeSO4浓度为横坐标绘制标准曲线为y=0.601 2x+0.0429，R2=0.9937。

竹菌的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇及蒸馏水提取物均具有氧化还原能力，且随着样品质量浓度的升高，氧化还原能力先上升，后趋于平稳状态。但不同溶剂提取物的清除效果存在差异：在提取物质量浓度为0.625～15 g/L时，竹菌不同溶剂提取物的氧化还原能力随FeSO4浓度增加而升高。FeSO4质量浓度为15 g/L时，石油醚提取物的总氧化还原能力最强（2.77±0.030），其次是乙酸乙酯提取物（2.14±0.030），再次是正丁醇提取物（1.52±0.002）和蒸馏水提取物（0.867±0.006），效果最差的是95%乙醇提取物（0.75±0.006）。其中，还原能力最大的为最小的3.693倍。

图5 竹菌不同提取物的总氧化还原能力

3 小结与讨论

天然产物成分中，萜类、甾体等大环、稠环化合物极性小，易溶于石油醚、乙酸乙酯等亲脂性溶剂，而糖、苷等极性较大物质易溶于水、乙醇等溶剂中，因此，采用不同溶剂进行竹菌成分提取所得产物，其所含功能分子应是不同的[21]。因此，选择5种不同极性溶剂进行竹菌抗氧化活性成分的提取，研究结果证明其在三个指标的评估中均显示有抗氧化活性。

另一方面，分别采用3种方法对竹菌的抗氧化活性进行评估，研究结果显示，不同方法测定结果中，5种提取物的抗氧化活性排序是存在差异的。DPPH法测得抗氧化活性由高到低依次为蒸馏水提取物＞乙酸乙酯提取物＞95%乙醇提取物＞正丁醇提取物＞石油醚提取物；ABTS法测得抗氧化活性由高到低依次为95%乙醇提取物＞蒸馏水提取物＞乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞石油醚提取物；FRAP法测得抗氧化活性由高到低依次为石油醚提取物＞乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞蒸馏水提取物＞95%乙醇提取物。究其原因，可能是因为：（1）DPPH法和ABTS法均是针对自由基清除能力设定的评估指标，但因为ABTS自由基较DPPH自由基反应更容易，且二者清除原理不同，因此，反映出的自由基清除能力也不同[22]；（2）FRAP法测定的是竹菌活性成分的氧化还原能力，原理自然不同与DPPH法和ABTS法[24]，因此，FRAP法测定结果与前两种方法完全不一致。由此可见，不同的分析方法对应不同的抗氧化原理，在天然产物抗氧化活性评估中结合多种指标进行研究是必要的。

首次对竹菌抗氧化活性潜能进行评估，分析结果显示，5种不同极性有机溶剂提取所得产物均具有抗氧化能力，可用于抗氧化剂开发。同时，竹菌为可食用真菌，使得其在开发利用方面天生就具有安全优势，未来可用于诸多领域，如具有清热解毒和抗氧化功能的饮品，食品保鲜剂，化妆品的抗衰老精华添加剂，抗炎症、预防癌症、预防肿瘤、抗氧化功能的新药等[23-24]。因此，在未来的研究中计划进一步采用高效液相色谱分离纯化体外抗氧化活性较好的提取物—乙酸乙酯及蒸馏水提取物中的有效成分，并通过细胞学试验进一步验证其抗氧化活性及安全性[25]。