健脾益气口服液对小鼠小肠推进功能的影响及其作用机制分析

刘巧明，谢 胜，奉建芳，王力宁，陈雅璐，林国彪，黄晓燕，梁健钦

（1.广西中医药大学，南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023）

功能消化不良（Functional dyspepsia，FD）是临床常见的胃肠道疾病，发病率高达40%，且具有难治性、反复性和慢性迁延等特点［1，2］，影响患者生活质量，临床上对治疗FD的药物需求大。FD的致病机理仍未完全清楚［3］，中医理论认为，FD是饮食不节与七情所伤导致，表现为脾胃虚弱、气机不畅、运化功能失调［4］。健脾益气口服液是广西中医药大学第一附属医院根据临床需要，对院内制剂健脾益气合剂按照中药1.1类新药要求开发得到的，由党参、陈皮、黄芪、白术、鸡内金、浮小麦、制何首乌、麦冬组成，具有健脾、益气的功效，临床治疗肺脾气虚型消化不良疗效良好，但其作用机制尚未清楚。本研究通过动物试验考察健脾益气口服液对小鼠小肠推进功能的影响，采用网络药理学技术分析FD发病机理，通过分子对接挖掘健脾益气口服液中活性成分及潜在有效靶点，预测健脾益气口服液治疗FD的作用机制，为阐明健脾益气口服液治疗FD以及新药开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 健脾益气口服液（广西中医药大学第一附属医院，规格：10 mL/支，批号：20180131），复方地芬诺酯片（安阳市华安药业有限责任公司，规格：2.5 mg/片，批号：161016）。

1.1.2 仪器 JJ200型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂），ST16R型台式低温离心机（Thermo公司），DW-HL388型-80℃超低温冰箱（中科美菱低温科技有限责任公司）。

1.1.3 动物 KM小鼠60只，SPF级，雌雄各半，18～22 g，购于广西医科大学，动物生产合格证号：SCXK桂2014-0002。饲养于广西中医药大学，试验前适应性饲养3 d，室温25～28℃，相对湿度60%～80%，标准饲料饲养，自由饮用去离子水。

1.1.4 数据库和软件 GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）、TTD数据库（https：//db.idrblab.org/ttd/）、PubChem Compound数 据 库（https：//pub⁃chem.ncbi.nlm.nih.gov/）、String数据库（version 11.0，https：//string-db.org/）、Drugbank数 据 库（version 5.1.1，https：//www.drugbank.ca/）、UniProt数 据 库（https：//www.uniprot.org/）、CNKI数据库（http：//www.cnki.net）、Cytoscape（version 3.7.2）、BATMAN-TCM数据库（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）、Swiss数 据 库（http：//old.swisstargetprediction.ch/）、Venn（version2.1.0，https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/ven⁃ny/index.html）、Discovery Studio（2016版）、RCSB数据库（https：//www.rcsb.org/）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药 取小鼠，随机分为空白组、模型组（生理盐水，7.8 mL/kg）和健脾益气口服液组（分为高、中、低、极低剂量组，给药剂量分别是31.2、15.6、7.8、3.9 mL/kg，相应地为人剂量的4.0、2.0、1.0、0.5倍），每组10只。灌胃给药，每日1次，连续4周。

1.2.2 墨汁推进率的测定［5］试验结束前各组小鼠禁食不禁水20 h后，药物组灌胃再给予一次相应的药液，模型组、空白组给予生理盐水。30 min后空白组给予生理盐水，其余各组给予复方地芬诺酯溶液（取复方地芬诺酯片20片，用乳钵研磨后，加去离子水至100 mL）10 mL/kg，30 min后各组再给予指示剂（墨汁：称取阿拉伯树胶100 g，加水800 mL，煮沸至溶液透明，加入活性碳粉100 g，煮沸3次，冷却后定容至1 000 mL），给药25 min后脱颈椎处死小鼠，剖开腹腔，用镊子不加牵引将肠管剥离，平铺于垫有干净白纸的手术台上，测量小鼠肠总长度（幽门至回盲部）及墨水推进长度（幽门至墨水最前沿），按“墨汁推进率=［墨汁在小肠中的推进距离（cm）/小鼠肠总长度（cm）］×100%”计算墨汁推进百分率。

1.2.3 统计分析 计数资料采用均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS 17.0进行统计分析，组间数据进行正态性和方差齐性检验符合方差齐性，采用t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

1.2.4 化学成分筛选及其作用靶点分析 以“DANGSHEN（党参）、HUANGQI（黄芪）、ZHIHESHOU⁃WU（制何首乌）、CHENPI（陈皮）、BAIZHU（白术）、MAIDONG（麦冬）、JINEIJIN（鸡内金）、FUXIAOMAI（浮小麦）”以及拉丁名为关键词，通过BATMANTCM（参数设定：score>25、P<0.05，其他参数为默认值）数据库、NCBI、CNKI数据库检索和筛选方中各药材的化学成分。通过PubChem Compound数据库检索获得化合物的3D结构，并保存为mol格式文件，导入Swiss数据库（选择物种为“Homo sapiens”，“Probability”>0.5）预测化学成分的作用靶点。通过Uniprot数据库校正靶点名称，并以来源是人类为条件寻找靶点的基因名。去除重复的化学成分作用靶点后，导入String数据库，设置参数（选择“Multiple protein”，研究对象“Homo sapiens”，最低互作置信度为“medium confidence（0.4）”，隐藏网络中无相互作用的靶点），进行靶点互作分析。

1.2.5 疾病靶点分析 以“functional dyspepsia”为关键词，检索TTD、Drugbank、GeneCards数据库FD的疾病靶点，其中GeneCards数据库的靶点筛选条件设置为score值>10，其余的均为默认值。同法使用Uniprot数据库校正靶点名称，删除重复靶点后，将疾病靶点导入String数据库获取蛋白互作信息，并保存为TSV文件格式，导入Cytoscape构建互作网络图，挖掘与FD发生和发展密切相关的关键靶点。

1.2.6 GO、KEGG富集分析 靶点导入String数据库进行蛋白互作分析和GO、KEGG富集分析。

1.2.7 分子对接 从PDB数据库下载对接蛋白的pdb格式文件。采用Discovery Studio 2016软件中Receptor-Ligand Interactions模块对靶点（受体）及化学成分（mol格式文件）分别进行预处理，包括去水、加氢、加力场、去除原配体等。以原配体的区域为对接位点，通过LibDock进行分子对接，参数设置为默认值。配体与受体的对接pose按Libdockscore排序，筛选出排名前3的pose，通过Calculate Binding Energies计算结合能（Binding Energy），按结合能大小排序。最后通过View Interactions可视化对接结果。

2 结果与分析

2.1 健脾益气口服液对小鼠小肠推进功能的影响

由表1所示，与空白组相比，模型组的墨汁推进率显著降低，表明抑制小肠运动模型建立成功。与模型组相比，健脾益气口服液高、中、低剂量组的小鼠小肠推进率显著增加（P<0.01），推进率与剂量正相关。

表1 健脾益气口服液对小鼠小肠推进的影响（±s，n=10）

表1 健脾益气口服液对小鼠小肠推进的影响（±s，n=10）

注：与空白组比较，“Δ”表示P<0.05；与模型组比较，“**”表示P<0.01

组别空白组模型组健脾益气口服液高剂量组健脾益气口服液中剂量组健脾益气口服液低剂量组健脾益气口服液极低剂量组给药剂量//mL/kg 10.0 31.2 15.6 7.8 3.9推进率//%67.42±8.66 54.68±9.74Δ 96.13±6.81**89.32±12.70**81.43±16.15**71.02±9.10**

2.2 化学成分及其作用靶点

共收集到毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素、谷甾醇、山奈酚、柚皮素、川陈皮素、党参炔苷、芒柄花苷、薯蓣皂苷元、辛弗林、亚油酸、二苯乙烯苷、黄芪甲苷、甜菜碱、苍术内酯、橙皮苷等194个化合物及703个化学成分作用靶点。如图1所示，党参、陈皮对应的作用靶点排前2位。对703个靶点进行富集分析，GO分析结果显示，健脾益气口服液参与小分子代谢、cGMP代谢、离子跨膜转运、氮化合物反应、激素水平调节、cAMP介导的信号转导及分解代谢、神经系统、磷酸核苷分解代谢、调节肽运输、免疫应答调节、前列素分泌、食欲调节等1 290个生物过程，以及影响胆汁酸、NO结合、cAMP介导环核苷酸磷酸二酯酶、神经递质受体活性等472个分子功能，细胞成分富集在质膜及其组成部分、突触部分、神经元、内质网、线粒体等部位。由图2所示，健脾益气口服液介导神经活性配体-受体相互作用、代谢途径、cAMP信号通路、多巴胺能突触、cGMP-PKG信号通路、Ca2+信号通路、味觉转导等通路对机体发挥作用。

2.3 FD疾病靶点预测及发病机制的分析

共筛选得到601个FD疾病靶点。Degree值排名前30的靶点（括号中是该靶点的Degree值）分别为INS（312）、GAPDH（287）、TP53（286）、AKT1（285）、IL6（282）、ALB（280）、VEGFA（258）、TNF（250）、EGFR（249）、MYC（247）、EGF（237）、MAPK3（236）、STAT3（228）、SRC（218）、CASP3（211）、JUN（210）、IGF1（208）、MAPK1（207）、HRAS（204）、MAPK8（203）、CXCL8（201）、NOTCH1（197）、CCND1（194）、PTEN（194）、FOS（189）、ESR1（189）、IL10（188）、MMP9（183）、IL1B（182）、TLR4（180）。Degree值的大小体现靶点与疾病相关性［6］，以上提示，上述靶点及其所涉及的通路与FD疾病的发生存在密切关系。进一步通过GO、KEGG分析发现，FD的发病过程涉及3 822个生物过程（主要有细胞对化学刺激的反应、高分子代谢过程的正调控、蛋白质磷酸化的调节、免疫系统过程、激酶活性的调节、MAPK级联反应的正调控、对炎症的反应等）、399个分子功能（包括蛋白质、酶、信号受体等的结合，跨膜受体蛋白酪氨酸激酶、磷脂酰肌醇3-激酶、受体配体、激素等的活性）、265个细胞成分（富集在细胞表面及外区域、囊泡、质膜、内膜系统、受体复合体、细胞质核周区域等部位），参与白介素信号、免疫系统及免疫系统中的细胞因子信号传导、受体酪氨酸激酶信号转导、胃泌素-CREB介导PKC-MAPK信号通路等595条信号途径。其中，癌症信号通路、PI3K-Akt信号通路、前列腺癌信号通路、癌症MicroRNA信号通路、乙型肝炎通路、内分泌抵抗通路、结肠癌通路、MAPK信号通路、胰腺癌、胃癌等通路的异常与FD发病密切相关。

2.4 健脾益气口服液干预FD机制

由图3所示，疾病靶点与健脾益气口服液靶点的共同靶点有104个（即核心靶点）。通过靶点网络互作分析，获得1个由104个节点、972条边、平均节点度为18.7、网络密度为0.57的网络。通过GO和KEGG富集分析可知，核心靶点主要富集在多细胞生物过程的调控、对有机氮化合物的响应、调节肽激素分泌、蛋白质磷酸化及一氧化氮生物合成过程的正调控等1 438个生物过程，富集在细胞外围、质膜、神经元、轴突、膜蛋白复合物等细胞组成，富集在受体结合、蛋白质结合、激素结合、G蛋白偶联的胺受体活性、磷酸酶结合、前列腺素-内过氧化物合酶活性等166个分子功能，参与调控癌症途径、TNF信号通路、IL-17信号通路、cAMP信号通路、cGMP-PKG信号通路、Ca2+信号通路等171条信号通路。药材-化学成分-核心靶点-通路网络图见图4。

2.5 活性成分和作用靶点的虚拟筛选

Ca2+信号通路、cAMP信号通路异常均可导致胃肠道运动障碍［7］。因此，本文选择cAMP信号通路、Ca2+信号通路的排名前2的靶点（即对接的受体）以及与Degree值排名前20的化合物（即对接配体）进行分子对接，受体与配体的结合能越小越稳定，最终筛选活性化合物与作用靶点。靶点分别为FOS（PDB∶1FOS）、EGFR（PDB∶2GS2）、CREB1（PDB∶5ZK1）、NOS3（PDB∶3EAH）。从分子对接模拟图（图5）可以看出，化合物以常规氢键、碳氢键、疏水作用、范德华力等作用方式与各靶点中对接位点氨基酸作用。其中，FOS、EGFR、CREB1、NOS3与烟酸（Nicotin⁃ic Acid）的结合能分别为-137.32、-130.05、-112.09、-143.99 kcal/mol，与苯丙氨酸（Phenylalanine）的结合能分别为-156.65、-130.18、-134.91、-112.91 kcal/mol，能量较低，表明化合物与靶点稳定结合。以上提示，烟酸和苯丙氨酸可能是与胃肠运动密切相关的活性成分，作用靶点极可能是FOS、EGFR、CREB1、NOS3。

3 小结与讨论

从中医角度辩证，FD与饮食不节、七情所伤有关，表现为脾胃虚弱、气机不畅、运化功能失调［4］。陈皮是理气、健脾之要药，能疏理气机健脾胃，党参则可补中、益气、健脾，两者相合具有补脾益气，增强胃肠道运化消胀功能，在治疗FD中起到重要作用。从本文建立“药材-化学成分-核心靶点-通路”网络可见，104个核心靶点及20个主要化合物归属于党参与陈皮，说明这两味药材在治疗FD中起关键作用，是方中君药。

研究表明，导致胃肠道运动障碍的机制有多个方面。一方面，线粒体功能的异常或数目、结构的改变［8，9］可导致胃肠道运动障碍。本文靶点互作分析发现，16.9%（119/703）的药物靶点富集在线粒体，包括线粒体呼吸体、线粒体外膜、线粒体呼吸链等11个线粒体部位，提示健脾益气口服液可以改善FD的线粒体异常。

另一方面，5-羟色胺（5-HT）、C-型钠尿肽（CNP）、多巴胺（DA）水平［10，11］异常可导致胃肠道运动障碍。国内外均有研究认为FD与焦虑、抑郁及免疫系统等因素紧密相关［12-14］。雌激素可作用于神经中枢调控情绪反应，还可在一定程度上对5-HT作用而影响情绪调控功能［15］；其水平波动较大时对胃功能有抑制作用，减缓胃排空速率和减少胃酸分泌［16］。5-HT在整个肠道中含量丰富，是大脑和胃肠道中的重要神经递质，在调节运动性和感觉方面起着关键作用［17］，过度表达会引起胃肠道敏感性增加，使得患者对胃肠的反应感到明显不适（如饱腹感、腹胀、腹痛等），还可带来一系列免疫反应，肥大细胞及脱颗粒增加、胃黏膜中肠嗜铬细胞增多等［18］。从核心靶点的互作网络分析结果提示，EGFR、FOS、CREB1、MAPK1、NOS3、PIK3CA、JUN、TNF等属于健脾益气口服液的核心靶点，它们与雌激素信号通路、神经活性配体-受体相互作用、血清能突触、TNF信号通路、内分泌等通路调节有关，最终可能调节雌激素、5-HT的水平。

再一方面，Ca2+信号通路、cAMP信号通路［7］异常可导致胃肠道运动障碍。Ca2+几乎涉及细胞内所有的生理活动［19］，其可介导信号通路，调节肠道细胞内Ca2+浓度，影响肠道运动；线粒体通过摄取Ca2+活化丙酮酸脱氢酶、IDH和α-酮戊二酸脱氢酶生成ATP［20］。本文发现，①化合物作用靶点参与机体的三羧酸循环及呼吸链的运转，提示化合物上调线粒体呼吸链复合物Ⅱ、Ⅳ与异柠檬酸脱氢酶（IDH）的表达，促进ATP合成，从而加强胃肠道平滑肌的收缩力促进胃肠运动；②KEGG富集分析表明FD的确与Ca2+信号通路、cAMP信号通路有关，排名前2位的靶点分别是FOS、EGFR、CREB1、NOS3，推测这些靶点与疾病的发生或治疗存在紧密的联系。酪氨酸蛋白激酶活性的细胞表面受体（EGFR）在胃肠道上皮组织中表达，其所介导的信号转导参与调节胃黏膜上皮更新和修复过程；NOS3在一定条件下可释放NO抑制胃肠道运动。经分子模拟对接验证，烟酸、苯丙氨酸可与FOS、EGFR、CREB1、NOS3在活性位点稳定结合。

综上，健脾益气口服液对小鼠小肠运动功能有促进作用，药物靶点富集在线粒体，预测它们参与Ca2+信号通路、神经活性配体-受体相互作用、多巴胺能突触和cAMP信号通路、血清能突触、TNF信号通路、内分泌抵抗、雌激素信号通路等多条信号通路调控，合成ATP为肠道蠕动提供动力，调控雌激素与5-HT的表达水平，增加胃酸分泌，加快胃排空速度以治疗FD。健脾益气口服液通过多成分、多靶点、多通路发挥疗效，需通过进一步试验验证靶点和活性成分。