HPLC法同时测定养心草中五种成分的含量

张 艳，丁仿霞，张建永

（遵义医科大学药学院，贵州 遵义 593099）

养心草学名景天三七（Sedum aizoonL.），又名费菜、土三七、养心菜等，为蔷薇目景天科的多年生草本植物，具有养心、平肝宁心、滋阴养血、活血止血之功效，在民间广泛将其作药食两用的天然物用于降血脂、降血压及相关心脏病的防治，也被称为“救心草”或“救心菜”，含有多酚类、黄酮类、生物碱、多糖、齐墩果酸、谷甾酸、氨基酸及维生素等成分［1，2］，其中黄酮类成分是养心草的主要有效成分，研究表明养心草总黄酮有抗氧化、抑菌、调节血脂以及抑制肝癌细胞增殖的作用［3，4］。所以测定养心草中黄酮类成分的含量可以对养心草的质量进行初步控制，为养心草总黄酮的进一步研究提供质量保证。经文献查阅，对养心草质量控制研究多是对其总黄酮或单一黄酮成分的含量测定［5-8］，未达到中草药多成分质量控制的要求。此外，梁泰刚等［9］、严劲松［10］分别采用HPLC法测定了养心草中2～3种黄酮类成分，本研究在已有文献的基础上，进一步通过对提取方法、色谱条件的优化，拟建立能够准确、灵敏、快速同时测定养心草中槲皮素、槲皮苷、芦丁、杨梅苷、山奈酚5种化学成分含量的方法，对养心草的质量进行初步控制，为养心草药食同源的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 Agilient Technologies 1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；HH-S6水浴锅，济南欧莱博科学仪器有限公司；KQ-300VDE双频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；RE2000A旋转蒸发仪，上海雅荣生化仪器厂。

1.1.2 药材与试剂 养心草全草采自遵义市新洲镇，经遵义医科大学张建永副教授鉴定为景天三七，杨梅苷（PS001009）、槲皮苷（PS000433）、槲皮素（PS010462）、山柰酚（PS001201）、芦丁（PS002032）对照品均购自成都普思生物科技有限公司，纯度>98%；甲醇，色谱纯，OCEA NPAK公司；磷酸，分析纯，成都市科龙化工试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 对照品储备液的制备 精密称取杨梅苷、芦丁、槲皮苷、槲皮素、山柰酚对照品适量，分别置10 mL容量瓶，甲醇溶解定容，制备得浓度依次为2.2、0.25、1.6、0.16、0.28 mg/mL的对照品储备液。

1.2.2 供试品溶液的制备 取养心草全草，粉碎，过四号筛，称取本品粉末约1.0 g，置250 mL圆底烧瓶中，加入25 mL 50%甲醇溶液，称定重量，90℃加热回流30 min，放冷，补足失重，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为样品溶液。

1.2.3 色谱条件 采用Gemini-Nx3μ-C18110A Phe⁃nomenex（150 mm×3.0 mm，3μm）色谱柱，流动相：甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，35%A；20～34.5 min，35%～36%A；34.5～35 min，36%～37%A；35～42.5 min，37%A；42.5～43 min，37%～54%A；43～49.5 min，54%A；49.5～50 min，54%～90%A；50～58.5 min，90%A；58.5～59 min，90%～35%A；59～64 min，35%A），流速0.4 mL/min；检测波长254 nm；柱温35℃；进样量20μL。

2 结果与分析

2.1 含量测定的方法学验证

2.1.1 色谱图 在“1.2.3”项的色谱条件下分别进样5种黄酮混合对照品储备液和养心草提取液进行色谱分析，得到图1。

2.1.2 线性与范围 依次精密量取杨梅苷、芦丁、槲皮苷、槲皮素、山柰酚对照品储备液适量于10 mL容量瓶，50%甲醇溶解定容，得到浓度依次为550、400、125、8、14μg/mL的混合对照品溶液，再依次量取混合对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL至10 mL容量瓶，50%甲醇溶解定容，得到系列浓度的混合对照品溶液，以峰面积y对浓度x（μg/mL）做回归曲线，回归方程、回归系数和范围见表1。

2.1.3 精密度试验 按“1.2.2”的方法制备供试品溶液，HPLC法连续进样6次，5种成分色谱峰面积的RSD值 分 别 为0.19%、0.67%、0.63%、1.83%、1.97%，说明仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性试验 按“1.2.2”的方法制备供试品溶液，在0、4、8、12、16、24 h分别进样分析，5种成分峰面积的RSD值分别为1.05%、2.71%、2.14%、3.54%、4.01%，说明样品溶液在24 h内稳定。

2.1.5 重复性试验 按“1.2.2”的方法制备供试品溶液6份，HPLC法进样分析，测定峰面积，计算含量，5种成分含量的RSD值分别为1.40%、1.50%、2.03%、2.15%、3.08%，说明方法的重复性良好。

2.1.6 加样回收试验 取已知含量的养心草约0.5 g，按低、中、高（每个梯度3份）分别加入适量对照品溶液，按“1.2.2”的方法制备供试品溶液，进样分析，测定峰面积，计算加样回收率，结果见表2。5种成分的平均加样回收率为95.61%～107.38%，RSD为1.37%～4.60%，说明该方法准确度良好。

2.1.7 样品含量测定 按“1.2.2”的方法制备供试品溶液6份，采用HPLC法进样分析，测定峰面积，计算5种成分的含量，结果见表3。由表3可知，RSD均小于5%，表明该方法准确可靠。

表2 加样回收试验结果（n=3）

表3 含量测定结果

2.2 提取工艺优化

2.2.1 单因素试验 以养心草中5种成分的总含量为考察指标，分别比较提取溶剂（30%、50%、70%、90%）、提取温度（70、80、90、100℃）和提取时间（20、30、60、90、120 min）对5种成分含量的影响，结果见图2。由图2可知，5种成分的总提取率分别在提取溶剂为50%甲醇、提取温度为90℃、提取时间为30 min时最高。

2.2.2 正交试验 在单因素试验的基础上，按L9（34）进行正交试验，因素与水平表见表4，结果见表5。由表5可知，3因素对5种成分总量的影响程度为提取溶剂>提取温度>提取时间，提取时间过长使苷类化合物的含量下降，结合单因素试验来看，综合考虑养心草中5种黄酮类化合物的最佳提取条件为A2B2C2，即提取溶剂为50%甲醇、提取温度90℃、提取时间30 min。

表4 正交试验因素与水平

表5 正交试验结果

3 小结与讨论

除试验采取的加热回流提取方法外，还对比考察了冷浸提取法和超声提取法，通过试验比较发现，加热回流提取方法较超声提取稳定，提取率较冷浸法高，所以选择加热回流为试验的提取方法。

在流动相的选择中，分别筛选了甲醇-0.2%乙酸水、甲醇-0.2%甲酸水、甲醇-0.2%磷酸二氢钾水、甲醇-0.2%磷酸水等系统，通过峰形、分离度、理论塔板数等对比，最后选用甲醇-0.2%磷酸水溶液进行梯度洗脱；对色谱柱进行筛选ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）、Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5μm）、Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）、Phenomenex Gemini-Nx3μ-C18110A（150mm×3.0 mm，3μm），最后选用Gemini-Nx3μ-C18110A（150 mm×3.0 mm，3μm），分离效果较好，流速小，节约试剂；筛选检测波长254、256、360和370 nm，经试验验证，检测波长为256 nm，各成分的含量及峰形较稳定。

本研究通过单因素试验和正交试验筛选出养心草中5种黄酮类成分（杨梅苷、芦丁、槲皮苷、槲皮素、山柰酚）的最优提取工艺，建立了以HPLC法为检测手段，同时测定5种成分含量的方法，方法准确可靠，为养心草的质量控制提供科学依据。