减施肥料配施根际促生菌对大豆-玉米间作根际土壤与作物生长的影响

舒健虹， 刘晓霞， 王子苑， 李 安， 蒙正兵， 王小利*

(1.贵州省农业科学院 草业研究所，贵州 贵阳 550006； 2.贵州大学 生命科学学院/农业生物工程研究院， 贵州 贵阳 550025)

0 引言

【研究意义】作物种植模式和施加生物有机肥是减少化肥施用、提高大豆的产量及土壤不同营养元素的利用效率的有效方式。间作可为资源需求特性不同的作物提供时间和空间上的生态位分离，促成作物高效利用光、热等资源，而且可改善根际土壤条件及微生物环境，同时改善作物根际土壤养分，可减少化肥的施用量[1-2]，抑制有害物质的积累[3]。【前人研究进展】禾豆间套作可缓解豆科作物生物固氮的“氮阻遏”作用[4]，是作物高效生产和低碳农业协调发展的一种较好种植模式[5]。当两个作物生长在一个空间，其竞争和促进作用相伴存在[6]。种间竞争作用是间作优势发挥的重要决定因素，在大豆-玉米间作中，群体内多数大豆产量降低，玉米产量增加[7]，其主要原因是缺乏适于间作的大豆品种[8]，而且间作群体中物种的竞争对低矮作物生长不利[9]。而根际促生菌(Plantgrowth promoting rhizobacteria, PGPR)是非致病有益的土壤根际细菌，PGPR能够通过固氮、溶磷、解钾及分泌植物激素如生长素(IAA)等促进植物生长发育[10-12]。在植物生长发育早期通过接种PGPR可直接影响植物根和芽的生长。这些机制包括活化各种微量营养元素，产生有机酸和植物激素，增强其他有益细菌对植物病害的控制[13-14]。而复合型菌剂可通过其相互作用实现微生物的多功能融合。【研究切入点】目前，对间作空间结构改变[15]、肥水管理[16]及密度调整[17]等调控种间关系的研究较多，对环境友好型生物肥料在间作中研究较少。随着环境C排放的影响和土壤有益微生物的减少，人们对发展绿色作物、环境友好型生物肥料、资源减投间作等相关技术的研究亟待深入。因此，探明减少化肥施用以提高大豆的产量及土壤不同营养元素的利用效率，同时保持群体的稳定性是急需解决的问题。【拟解决的关键问题】选用盆栽方式进行大豆-玉米间作，接种PGPR复合菌肥进行处理，分析低氮、磷条件对间作体系生物产量和养分利用效率的影响，以期发挥群体最大优势，减少间作竞争对大豆生长的不利因素，同时改善土壤微生物环境。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤 供试土壤为黄壤，采集于贵州省农业科学院内。土壤基本理化性质为 pH 6.94，有机质41.16 g/kg，全氮1.79 g/kg，碱解氮246.9 mg/kg，速效磷24.2 mg/kg，速效钾162.0 mg/kg。经自然风干后磨碎，过2 mm筛，采用土壤和蛭石(体积比为2∶1)混匀后装入灭菌袋中进行高压蒸汽灭菌(121℃灭菌30 min)。花盆长43.3 cm，宽19.5 cm，高13.5 cm。混合土壤4 kg +磷矿粉150 g混合均匀装入盆中。

1.1.2 菌种 供试菌种由当地白三叶和野木豆根瘤分离筛选且在大豆植株上回接表现较好的菌株，分别是根瘤菌属菌种R325-3(Rhizobiumsophorae)和内生菌嗜麦芽窄食单胞菌R287-5(Stenotrophomonasmaltophilia)，保存于贵州省草业所实验室捷克产Thermo超低温冰箱中，其活化和菌液培养方法参照文献[18]。

1.1.3 植物 供试植物为玉米品种金玉818和有藤蔓的大豆地方品种，均购自贵州省贵阳市种子交易市场。挑选籽粒均匀饱满的种子，用10%次氯酸钠进行表面消毒 20 min，再用蒸馏水冲洗3～4次，用OD=0.6～0.7(λ=600 nm)的1∶1混合菌液浸种45 min，然后置于放有湿润定量滤纸的培养皿中，在25℃恒温培养箱中催芽1 d 后播种。

1.2 试验设计

试验于2020年5月下旬在贵州省草业研究所人工气候室进行，气候室内昼夜温度分别为24℃和21℃，光照时间16 h，用含70%的N和P的Hoagland营养液(低氮、磷肥施用)隔日浇灌500 mL保持土壤湿润。试验设置种植模式、接种方式2个因素，共涉及大豆单作、大豆-玉米间作和玉米单作3种种植方式和不接种 PGPR、接种PGPR 2 种菌根处理，共计6个处理(表1)，每个处理重复5次，共30盆，单作每盆6株植株，间作为中间2株玉米，两边2株大豆，6株/盆，植物生长40 d后收获。

表1 大豆-玉米间作处理的试验设计

1.3 测定方法

1.3.1 样品采集 将植株地上部与地下部分开收获，单作中每个重复随机选取2株共10株作为样本数，间作每盆玉米和大豆各取2株共10株作为样本数，分别测量株高、叶片(大豆含叶柄)长、根长、地上地下生物量，植株高度为地面到叶尖端的高度。105℃杀青15 min，65℃烘干至恒重，称量植株地上部分干重、粉碎后放置待用。

1.3.2 土壤营养成分和酶活性分析 植株收获后收集盆栽土壤过2 mm筛后混匀，取部分新鲜土样置于4℃冰箱待测土壤NH4+-N、NO3--N，部分土样经风干后分析有机质、蛋白酶活性及土壤脲酶、硝酸还原酶活性、土壤速效P。利用KCl浸提，紫外分光光度法测定铵态氮和硝态氮含量[19-20]，碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定速效磷[20]，土壤脲酶活性采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定[21]，土壤酸性蛋白酶活性采用比色法测定(Solarbi公司BC0865试剂盒)，硝酸还原酶活性采用比色法测定(Solarbi公司BC3105试剂盒)。

1.3.3 植株营养成分指标测定 植物粗蛋白(CP)含量采用硫酸-加速剂消解后利用凯氏法测定；植物全磷(P)含量采用硫酸-双氧水消解后利用钼锑抗比色法测定；植物全钾(K)含量按NY/T2017—2011标准采用火焰原子吸收分光光度法。

1.4 数据处理

采用Excel 2003和SPSS 18.0进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理大豆和玉米的植株及根系

由表2可见，大豆玉米的植株及根系性状。

表2 不同处理大豆、玉米的植株及根系生长情况

2.1.1 大豆 大豆单作和间作中接种复合菌剂的植株与无菌剂相同种植模式相比，株高、叶长、根长和根系干重均有所增加。其中单作，处理4与处理1相比，株高和根系干重分别增加7.85%和237.50%，差异极显著；叶长显著增加5.05%；根长增加不明显。间作，处理6与处理3相比，株高增加6.39%，差异极显著；叶长、根长和根干重有所增加但差异不明显。株高处理6>处理4>处理3>处理1，处理6比处理1极显著增高12.47%，处理3比处理1极显著增加5.27%；叶长处理6比处理1显著增加

5.33%，处理3与处理1差异不显著；根长处理4>处理1>处理6>处理3，处理3比处理1显著降低22.71%，处理6与处理1相比降低8.1%；根系干重处理4>处理6>处理3>处理1，处理4显著高于其余处理，处理6与处理1和处理3相比差异不明显。

2.1.2 玉米 玉米植株其株高、叶长和根系干重施加促生菌比无菌处理有所增加。在单作中，植株叶长处理5与处理2相比极显著增加23.43%，株高极显著增高12.99%，根系干重显著增加35.09%，根长有所降低，但差异不显著；间作中，植株株高、叶长处理6与处理3相比分别显著增加6.47%和12.50%，根长和根干重有所增加，但差异不显著；玉米植株的株高处理5>处理6>处理3>处理2，处理6与处理2相比极显著增加7.65%，叶长处理5>处理6>处理3>处理2，处理6与处理2相比极显著增加19.74%，根系干重处理6>处理5>处理3>处理2，处理6与处理2相比极显著增加84.21%，处理3与处理2相比，株高和叶长差异均不显著，根长处理6与处理2相比有所降低但差异不显著。

2.2 不同处理大豆、玉米的地上干物质产量

由表2可见，作物在接种复合菌剂后对植株地上干物质产量促生效果显著(除单作玉米)，大豆处理4与处理1相比显著增加21.47%，大豆植株在处理6中比处理5极显著增加50.17%；玉米处理5与处理2相比有所增加，但差异不显著，处理6的植株比处理5显著增加10.35%；作物混合产量处理6比处理5极显著增加21.76%。间作处理6可促进大豆和玉米植株的生长，间作施入促生菌剂的植株干物质产量优于无菌剂处理。

2.3 不同处理大豆、玉米的营养成分

从图1看出，大豆植株在单作模式下氮、磷含量处理4比处理1分别增加7.13%和24.32%，差异极显著，钾含量有所降低，但差异不显著；间作植株氮含量处理6比处理3极显著降低7.22 %，植株磷、钾含量处理6比处理3分别降低3.91%和5.32%，但差异不显著；处理6比处理1的植株氮、磷含量分别增加8.76%和33.82%，达极显著水平，钾含量比处理1增加7.01%，差异不显著。

玉米植株在单作模式下氮、钾含量处理5与处理2相比分别增加8.48%和11.91%，达极显著水平，磷含量增加0.33%，差异不显著；间作模式下处理6与处理3相比植株氮含量极显著降低12.71%，磷含量极显著增加9.12%，钾含量增加0.42%，差异不显著，玉米植株氮、钾含量，处理6比处理2分别显著增加5.28%和15.04%，磷含量比处理2降低0.13%，差异不显著。

注：不同大写字母表示不同处理间差异显著(P<0.01)，小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

2.4 不同处理大豆和玉米的根际土壤酶活性

由表3可以看出，不同的种植模式，土壤酸性蛋白酶活性处理4、处理5和处理6比处理1、处理2和处理3的酶活高。其中玉米植株处理6的根际土壤与处理2和处理3相比分别增加16.00%和31.82%，达极显著水平；大豆植株处理6的根际土壤与处理1和处理3相比分别增加28.89%和31.82%，达极显著水平，土壤酸性蛋白酶活性以单作玉米处理5的酶活最高，其次为处理6的土壤。

表3 不同处理大豆、玉米的根际土壤酶活性

土壤脲酶活性以处理5的酶活最高，其次为处理3的土壤，最低的是处理1的土壤。玉米、大豆单作土壤处理5与处理2、处理4与处理1相比分别增加650%和62.5%，达极显著水平；间作土壤中的脲酶活性处理6与处理3相比极显著降低24.20%，处理6与处理1和处理2的土壤分别增加395.83%和440.91%，达极显著水平。

土壤硝酸还原酶活性，大豆根际土壤处理4比处理1极显著降低41.54%，玉米根际土壤处理5比处理2极显著增加23.90%；间作土壤处理6与处理3相比下降7.01%，差异不显著；处理6的土壤与处理1的土壤相比硝酸还原酶活性极显著降低34.08%。

2.5 不同处理大豆、玉米的根际土壤中氮及有效磷含量

由图2可看出，大豆根际土壤处理4与处理1相比，NH4+-N含量显著降低17.09%，NO3--N含量极显著降低33.80%，有效磷含量有所增加，但差异不显著。处理6与处理1相比，NO3--N含量极显著降低69.98%，NH4+-N含量极显著增加61.11%，有效磷含量显著下降5.84%。

图2 不同种植模式下土壤中不同形态氮及有效磷的含量

玉米根际土壤处理5与处理2相比，NH4+-N含量极显著升高86.10%，NO3--N和有效磷含量分别降低41.18%和20.73%，达极显著水平。处理6的土壤与处理2相比，NH4+-N和NO3--N的含量分别增加27.80%和40.63%，差异极显著，有效磷的含量极显著降低8.41%。

混合土壤中处理6与处理3相比，NH4+-N含量显著下降11.29%，NO3--N和有效磷含量分别下降33.27%和12.10%，达极显著水平。处理3的土壤NO3--N∶NH4+-N为4.76∶1，处理6的土壤NO3--N∶NH4+-N为3.58∶1。

3 讨论

研究表明，干物质积累是作物产量形成的物质基础，增加干物质积累量对作物增产具有重大意义[22]，促生菌对紫花苜蓿(MedicagosativaL.)、箭舌豌豆(Viciasativa)、玉米等可促进根系生长和产量提高[23-25]，同时大多数联合固氮菌具有分泌IAA能力，从而促进植株的增高和根系的生长[26]。试验在低氮磷间作模式下施入促生菌处理的植株混合产量极显著高于无菌处理。单作模式下，大豆植株地上干物质产量处理4(大豆单作+复合菌)比处理1(大豆单作，未施加复合菌)极显著增加。处理4(大豆单作+复合菌)能促进大豆植株的株高、叶长、根长、根系的生长，且促生处理效果最佳；玉米植株的株高和叶长均显著高于处理2(玉米单作，未施加复合菌)。间作模式，大豆植株的株高处理6(大豆玉米间作+复合菌)比处理3(大豆玉米间作，未施加复合菌)极显著增高，对玉米植株株高和叶长的生长显著增加。可见，在低氮磷条件下接种促生菌，单作比间作栽培对大豆促生效果更显著，间作优化了大豆在群体中的空间分布，同时也能促进玉米的生长。

促生菌可优化豆-禾间作竞争与互补协同作用，增强土壤中氮、磷、钾元素协调利用。研究证明，NO3--N较NH4+-N相比对豆科植物结瘤的抑制作用较大[27]。硝态氮对小麦、玉米等作物的生长多具有促进作用[28]。较低浓度的NO3--N对接种根瘤菌的大豆植株根毛结瘤的形成有促进作用[27]，且促生菌能分泌有机酸(甲酸、乳酸、葡萄糖酸、柠檬酸等)降低pH，与铁、铝、钙等离子螯合，使难溶性磷转化为有效磷[29]。试验中大豆根际土NO3--N含量处理1(大豆单作，未施加复合菌)最高。间作混合土壤处理6(大豆玉米间作+复合菌)与处理3(大豆玉米间作，未施加复合菌)相比，NO3--N含量下降差异极显著，NH4+-N含量下降差异显著。间作中处理3土壤(NO3--N)∶(NH4+-N)为4.76∶1，处理6土壤(NO3--N)∶(NH4+-N)为3.58∶1，促生菌缩小了NO3--N和NH4+-N在大豆-玉米间作土壤中的差距。植株中氮元素含量的增加可促进磷元素的吸收，但磷含量增加对氮元素吸收有拮抗作用[30]，单作模式，大豆植株氮和磷含量处理4比处理1分别极显著增加7.13%和24.32%，玉米植株的氮、钾含量处理5(玉米单作+复合菌)比处理2(玉米单作，未施加复合菌)分别极显著增加8.48%和11.91%。大豆、玉米植株氮、磷、钾含量处理6(大豆玉米间作+复合菌)显著高于处理1(大豆单作，未施加复合菌)和处理2(玉米单作，未施加复合菌)，玉米植株磷含量除外。大豆、玉米植株氮含量处理6(大豆玉米间作+复合菌)比处理3(大豆玉米间作，未施加复合菌)分别极显著降低7.22%、12.71%，玉米植株的磷含量显著增高9.12%，可能土壤中有效磷的增加促进了玉米植株对磷元素的吸收，同时也对氮元素的吸收有抑制作用，或作物地上干物质的增加导致植株氮、磷元素含量降低。可见，大豆-玉米间作下施入促生菌能减少土壤中硝态氮的含量，加速植株对土壤铵态氮和硝态氮的吸收利用，促进植株生长，降低种间竞争作用，同时可挖掘不同作物对氮、磷、钾高效利用的生物学潜力，促进生物多样性和生态系统稳定性。

土壤酶来源于微生物细胞并具有一定催化功能，蛋白酶参与土壤中氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物的转化，其水解物是植物的氨源之一。脲酶是极为专性的一种酰胺酶，仅能水解尿素成氨、二氧化碳和水。硝酸还原酶催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，是土壤硝态氮还原的关键酶。这3种酶可以影响土壤N素的矿化、硝化、氨化及尿素水解过程，是衡量土壤微环境的重要因子之一。土壤酶活大部分表现为2种作物在间作根际土壤中均大于相应的单作[31]。试验中，单作模式，处理4(大豆单作+复合菌)与处理1(大豆单作，未施加复合菌)相比，大豆根际土壤脲酶活性极显著增高，同时硝酸还原酶活性极显著降低；玉米根际土壤中蛋白酶活性、脲酶活性和硝酸还原酶活性极显著增高。间作处理6的混合土壤与处理1(大豆单作，未施加复合菌)和处理2(玉米单作，未施加复合菌)大豆、玉米根际土壤相比，脲酶活性极显著增高。处理6(大豆玉米间作+复合菌)比处理3的混合土壤酸性蛋白酶活性极显著增高。可见，间作模式下接种促生菌剂有利于提高土壤中酸性蛋白酶的活性，这将有利于豆科植株有效根瘤的形成，从而促进大豆的生长。

4 结论

试验结果表明，在低氮磷大豆玉米间作模式下接种促生菌剂，处理6(大豆玉米间作+复合菌)与处理3(大豆玉米间作，未施加复合菌)相比，大豆植株的株高极显著增高6.39%，玉米植株株高和叶长的生长显著增加6.47%和12.5%，作物混合产量处理6(大豆玉米间作+复合菌)比处理3(大豆玉米间作，未施加复合菌)极显著增加21.76%，玉米植株磷含量显著增高9.12%。促生菌的间作模式可优化大豆在群体中的空间分布，提高系统混合干物质产量，同时也能促进玉米生长；间作模式下，处理3(大豆玉米间作，未施加复合菌)的土壤(NO3--N)∶(NH4+-N)为4.76∶1，处理6(大豆玉米间作+复合菌)的土壤(NO3--N)∶(NH4+-N)为3.58∶1；处理6(大豆玉米间作+复合菌)比处理3的混合土壤酸性蛋白酶活性极显著增高31.82%。间作模式下接种促生菌剂缩小NO3--N和NH4+-N在大豆-玉米间作土壤中的差距，改善土壤微域环境。总之，接种促生菌的间作模式可在一定程度上促进大豆的生长，减少化肥施用，提高大豆地上生物量及土壤不同营养元素的利用效率，促进群体环境趋于稳定性，是一种较好的种植方式。