长链非编码RNA FER1L4在肾癌组织中的表达及其对肾癌细胞增殖侵袭和迁移的影响

雷坤阳 谢文杰 孙庭

长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是指一类长度＞200 nt 的转录本。虽然LncRNA不具备翻译功能，但其参与基因表达的转录调控以及细胞中的信号传递。研究表明，人为沉默或过表达LncRNA 将对肿瘤进展产生影响，有关LncRNA 研究是目前的热点之一[1]，并已多有在肾癌中作用的报道[2-3]。LncRNA FER1L4 是一个近年来新发现的LncRNA，在胃癌中最早被研究[4]。LncRNA FER1L4 在多种肿瘤中异常表达，如肝细胞癌及卵巢癌等，并在这些肿瘤的发生和进展中均起到至关重要的作用[5]，但在肾癌中尚鲜有报道。本研究旨在对LncRNA FER1L4 在肾癌中的作用及其分子生物学机制进行初步探讨。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 GEPIA 数据库 通过GEPIA 数据库分析523例患者的肾癌组织及其中100 例患者的配对癌旁组织中的LncRNA FER1L4 表达水平，分析516 例肾癌患者的组织标本（258 例高表达、258 例低表达）与生存期的关系。

1.1.2 临床标本 收集2020年1月至2021年1月65例于南昌大学第一附属医院行肾癌根治术患者的肾癌组织及癌旁组织标本，所有标本均经病理诊断为肾细胞癌，组织标本采集后立即放入液氮，并放至-80℃冰箱内保存。患者术前均未行放射治疗、化疗或靶向治疗。根据LncRNA FER1L4 表达水平的平均值，将65 例肾癌组织分为高表达组（n=32）和低表达组（n=33）。本研究获得本院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.1.3 主要试剂 RNA 抽提试剂盒购自上海康为生物公司；逆转录及定量逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）扩增试剂盒购自武汉赛维尔生物公司；转染试剂Lipofectamine 3 000 购自美国Invitrogen 公司；siRNA 购自广州锐博生物公司；所有抗体均购自美国Cell Signaling 公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR 采用Trizol 试剂盒提取组织及细胞中的RNA，紫外分光光度计检测所提取RNA 的浓度，使用逆转录试剂盒合成cDNA，并用PCR 仪进行扩增。LncRNA FER1L4 引物的上游序列为5′-GGGG ACGGAAGATGACC-3′，下游序列为5′-TTGTGAAC CCGCTGAAGA-3′；内参GAPDH 引物的上游序列为5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，下游序列为5′-A TGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′。

1.2.2 细胞培养及转染 人正常肾小管上皮细胞（HK-2）以及5 种人肾癌细胞系（786-O、A498、ACHN、OSRC2、769-P）分别购自中科院细胞库及武汉普诺赛生命科技有限公司。将细胞放置在温度为37℃，CO2浓度为5%的培养箱中，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基进行培养，每3 天更换1 次培养基。待细胞生长至30%～50%密度时，使用Lipofectamine 3 000将LncRNA FER1L4 的siRNA（Si）组、阴性对照（NC）组以及空白对照（BC）组分别转染至细胞。

1.2.3 CCK8 实验 将细胞消化、离心并重悬，调整细胞密度为1×104/mL，加入0.2 mL 细胞悬液到96 孔板中，培养24、48 及72 h 后，分别加入CCK-8 试剂10 μL/孔，在37℃条件下培养2～4 h，在450 nm 处检测各组细胞的吸光度。

1.2.4 平板克隆实验 将细胞消化、离心并重悬，调整细胞密度为1×103/mL，加入0.3 mL 细胞悬液到6孔板中，每隔3 天更换1 次培养基。待2 周后或可肉眼观察到明显集落形成时，PBS 清洗细胞，甲醛固定，并用0.1%结晶紫染色。拍照并计算集落形成率。

1.2.5 划痕实验 将细胞均匀接种至6 孔板中，待细胞密度达到80%时，使用200 μL 枪头在每孔中进行“十”字划痕，PBS 清洗后用无血清培养基培养，在0 和第24 h 在显微镜下拍照，并计算细胞迁移的距离。

1.2.6 Transwell 实验 在Transwell 小室的上室中加入基质胶，待其凝固后备用。在下室中加入600 μL含20%胎牛血清的培养基，放入Transwell 小室。将细胞常规消化、离心后，用无血清培养基重悬，调整细胞密度为1×105/mL，在上室中加入细胞悬液0.2 mL。培养24 h 后用甲醛固定，0.1%结晶紫染色。用棉签将上室擦洗干净，风干后在显微镜下拍照并计数。

1.2.7 Western blot 检测 采用Western blot 检测肾癌细胞中上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）通路相关蛋白表达的变化。使用RIPA裂解液将细胞裂解并提取蛋白质，BCA 法检测蛋白浓度。使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。将聚偏二氟乙烯膜与一抗孵育过夜后再与二抗孵育1 h，最后用显影液进行成像并分析各条带的灰度值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0 软件进行统计学分析。连续性变量采用x±s表示，组间比较采用t检验或χ2检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肾癌组织和细胞中LncRNA FER1L4 表达与临床病理学特征的关系

对GEPIA 数据库相关的数据分析显示，与癌旁组织相比，肾癌组织中的LncRNA FER1L4 高表达（图1A），并且高表达患者的生存期更短（P＜0.05，图1B）。RT-qPCR 检测显示，65 例患者肾癌组织中的LncRNA FER1L4 表达为8.63±1.79，明显高于癌旁组织的1.84±0.95，两者比较差异具有统计学意义（P＜0.001，图2A）；肾癌细胞系786-O 中的LncRNA FER1L4 表达为5.45±0.72、A498 为3.52±0.54、ACHN为2.75±0.45、OSRC2为4.98±0.86、769-P为3.31±0.71，均明显高于正常肾小管上皮细胞的1.00±0.15，差异均具有统计学意义（均P＜0.05，图2B）。由于LncRNA FER1L4 在786-O 和OSRC2 细胞系中的表达最高，因此选择这2 种细胞系用于后续实验。本研究分析发现，肾癌组织中的LncRNA FER1L4 高表达与肿瘤体积、肿瘤分期、淋巴结转移及远处转移呈显著相关，而与其他临床病理特征无关（均P＜0.05，表1）。

图1 肾癌组织中的LncRNA FER1L4 表达与患者生存期的关系

图2 肾癌中LncRNA FER1L4 的表达

表1 65 例肾癌患者组织中的LncRNA FER1L4 表达与临床病理学特征的关系

2.2 LncRNA FER1L4 对体外肾癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

CCK-8 及平板克隆实验结果显示，与NC 组及BC 组相比，Si 组细胞的增殖能力明显减弱，差异具有统计学意义（均P＜0.05，图3，图4A）；Transwell 实验结果显示，Si 组细胞的侵袭能力明显低于NC 组及BC 组，差异具有统计学意义（P＜0.05，图4B）；划痕实验结果显示，Si 组细胞的迁移能力与NC 组及BC 组相比明显降低（P＜0.05，图4C）。

图3 LncRNA FER1L4 对肾癌细胞增殖能力的影响

图4 LncRNA FER1L4 对肾癌细胞的影响

2.3 LncRNA FER1L4 通过EMT 信号通路对肾癌的影响

Western blot 检测显示，Si 组细胞的Vimentin 和N-cadherin 的表达下调，而E-cadherin 表达上调（均P＜0.05，图5），LncRNA FER1L4 可能通过激活肾癌细胞中的EMT 从而促进肾癌的进展。

图5 沉默LncRNA FER1L4 的各组细胞中的EMT 通路相关蛋白变化

3 讨论

肾癌是人类常见的恶性肿瘤之一，且死亡率一直呈上升趋势[6]。在肾细胞癌分型中，以透明细胞癌占多数，且对放射治疗和化疗均不敏感[7]，通过肾根治性切除术，复发率仍高达20%～40%，术后5年生存率仅为20%[8]。因此，靶向药物治疗作为一种新兴的治疗方法越来越受到重视，寻找新的靶点则成为目前分子生物学领域最急迫的任务[9]。

LncRNA FER1L4 在恶性肿瘤中的作用已多有研究报道，如LncRNA FER1L4 在高级别胶质瘤中的表达明显高于低级别胶质瘤，并且与患者的不良预后相关，沉默LncRNA FER1L4 的表达，胶质瘤细胞的生长明显被抑制[10]；LncRNA FER1L4 在体外可促进口腔鳞癌细胞的增殖、侵袭和迁移，沉默LncRNA FER1L4 的表达可抑制癌细胞在体内成瘤的作用[11]。LncRNA FER1L4 还可作为抑癌因子在肿瘤中发挥作用，如过表达LncRNA FER1L4 可促进骨肉瘤细胞的凋亡，从而抑制肿瘤的进展[12]。本研究为了探究LncRNA FER1L4 在肾癌中的作用，对GEPIA 数据库进行检索，并分析了肾癌中LncRNA FER1L4 的表达及其与患者生存期之间的关系，结果显示肾癌组织中LncRNA FER1L4 高表达，并且其表达量与患者生存率呈负相关。为了研究LncRNA FER1L4 在肾癌组织及细胞中的表达量，本研究采用RT-qPCR 检测肾癌患者组织及各个肾癌细胞系中LncRNA FER1L4表达，发现肾癌组织及细胞中的LncRNA FER1L4 表达明显高于癌旁组织及正常肾小管上皮细胞。为验证LncRNA FER1L4 在肾癌中的作用，本研究体外实验结果显示，沉默LncRNA FER1L4 可抑制肾癌细胞的增殖、侵袭和迁移。

EMT 与癌细胞的转移能力密切相关。EMT 通路涉及包括Vimentin 和E-cadherin 等多种蛋白。由于大多数肿瘤的进展过程中往往伴随着EMT 发生，EMT 在恶性肿瘤细胞的侵袭和迁移过程中起着至关重要的作用，已有研究证实了LncRNA FER1L4 与EMT 的关系[13]。本研究采用Western blot 检测显示，沉默LncRNA FER1L4 表达，肾癌细胞中的Vimentin 和N-cadherin 表达下调，而E-cadherin 表达上调。由此，可以推断LncRNA FER1L4 促进肾癌细胞侵袭和迁移的作用可能部分与EMT 有关。但LncRNA FER1L4 对肾癌细胞增殖作用的影响无法用EMT 机制解释，研究显示肿瘤细胞的增殖受PI3K/AKT 信号通路以及JAK/STAT 信号通路的调控[14-15]，但有待进一步研究与验证。

综上所述，肾癌组织和细胞中的LncRNA FER1L4表达上调，与患者的肿瘤直径、肿瘤分期、淋巴结转移及远处转移相关。LncRNA FER1L4 可通过影响EMT 而促进肾癌的进展，并为肾癌的靶向治疗提供了新的思路，但其具体机制尚需进一步研究。