基于超高效液相串联飞行时间质谱技术分析小扁豆豆壳多酚组成及其抗氧化活性

裴敏佳，王晓雅，熊 华，王凤新，孙 永*

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.江西人之初营养科技股份有限公司，江西 南昌 330052)

小扁豆(Lentil,Lensculinaris)是中国、加拿大、美国、印度等地主要粮食作物之一[1]，通过摄入小扁豆可以降低与生活方式相关的慢性疾病的患病风险，如降低人体胆固醇和血脂，降低结肠癌和2型糖尿病的发病率[2]，因此备受关注。美国国家心肺血液研究所(NHLBI)将食用小扁豆作为高血压防治计划(DASH)中的选项之一，以降低血压和血液中的低密度脂蛋白[3]。小扁豆在加工过程中会产生一系列副产物，包括豆壳、破碎的子叶以及富含淀粉和蛋白质的面粉，在工业生产中造成10%～21%的损失[4]。豆壳是其主要副产物，其含量约占整颗扁豆种子重量的8%～11%[5]。豆壳富含纤维素、微量元素以及植物化学物，具有很高的应用价值。目前黄豌豆壳纤维已广泛应用于食品中，其对老年人健康的益处已被报道[6]。Kaya[7]等人发现在面条中添加10%的豆壳不仅可以提高其营养价值，还可以增加面条的吸水能力，膨胀体积。此外，在酸奶中添加一定量的小扁豆豆壳可以起到益生元的作用[8]。据报道，小扁豆豆壳富含多酚类成分[9]。然而，现有报道多集中于对小扁豆中游离态多酚进行分析，缺乏对小扁豆豆壳中结合态多酚组成及其抗氧化活性的研究。

多酚是植物重要的次生代谢物，具有抗炎、抗氧化等生物活性。根据结合方式的不同，可以将食品基质中的多酚分为游离酚(包括可溶性共轭酚)以及结合酚两种形态[10]。游离态多酚以单体形式存在于食品基质中，易溶于水或有机溶剂，能被直接萃取。结合态多酚通过酯键、醚键、糖苷键等共价键与食品基质(如细胞壁物质、蛋白质等)相结合，具有难萃取的特点[11]，需要借助酸水解、碱水解或者酶解的方法，将多酚与其它分子之间的连接断开后再进行提取。结合酚不能被胃和小肠消化吸收，但可在结肠中经微生物发酵释放并产生生物活性[12]，相较于游离酚，结合酚类物质经肠道微生物作用后可能发挥更强的生物活性[13]。对不同形态多酚进行定性定量分析有助于进一步探索其构效与功能的关系。

本研究以两种不同颜色小扁豆豆壳为原料，基于化学法、气相色谱质谱联用法测定其基本成分组成，通过化学法和UPLC-ESI-QTOF-MS2鉴定其不同形态多酚结构和测定其抗氧化活性。本研究可以为小扁豆豆壳酚类物质在食品中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

小扁豆豆壳：来自两种小扁豆(ADM Red和ADM Eston Green，分别为红色扁豆和绿色扁豆)的加工废弃物，由加拿大圭尔夫农业和农业食品研究和发展中心馈赠。样品烘干后粉碎，于-20 ℃保存。

硫酸、石油醚、正己烷、甲醇：分析纯，均购于西陇科学股份有限公司；福林酚：美国Sigma公司；没食子酸(Gallic acid,GAE)、儿茶素(Catechin,CAE)、奎诺二甲基丙烯酸酯(Trolox)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、2,2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、甲醇：色谱纯，美国TEDIA试剂公司。

1.1.2 主要仪器设备

电子天平：ME204/02,梅特勒-拖利多仪器(上海)有限公司；高速离心机：LXJ-IIB，上海安亭科学仪器厂；冷冻干燥机：LGJ-18，北京松源华兴科技发展有限公司；自动凯氏定氮仪：K9840，济南海能仪器股份有限公司；纯水机：PTC-MBR-M，上海和泰仪器有限公司；全自动氨基酸分析仪：S-433D，德国Sykam公司；气相色谱-质谱联用仪：8860/5977，美国安捷伦公司；旋转蒸发仪：RV10，德国IKA公司；酶标仪：Synergy H1，美国Bio Tek仪器公司；液相色谱-质谱联用仪：6545 LC/Q-TOF，美国安捷伦公司

1.2 方法

1.2.1 基础营养成分测定

蛋白质含量的测定参照《GB 5009.5-2016食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的“凯氏定氮法”[14]，蛋白质换算系数为6.25；粗脂肪含量的测定参照《GB 5009.6-2016食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中的“索氏抽提法”[15]；灰分的测定参照《GB 5009.4-2016食品安全国家标准食品中灰分的测定》[16]。

1.2.2 脂肪酸组成

样品油脂甲酯化参考冯明菊[17]等人的方法。GC条件如下：气相色谱柱：DB-FATWAX UI(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，流速：1 mL·min-1，进样口温度230℃，载气：氦气，升温程序为40℃保持2 min，55 ℃/min升温至170℃，保持25 min后以10℃/min的速率上升到215℃，保持25 min，分流比为20：1。MS条件：EI离子源，70 eV电子能量，扫描方式为全扫描，质量扫描范围35～500 amu。脂肪酸的鉴定是基于与脂肪酸甲酯的标准化合物相比的保留时间，通过面积归一法进行定量。

1.2.3 游离氨基酸测定

称取1g左右样品，用50 mL 0.01N盐酸浸提30 min，摇匀后过滤，准确吸取滤液2 mL，加入2 mL 8%磺基水杨酸，混匀，静置15 min，3000 r·min-1离心20 min，取上清液过0.45 μm膜后上机检测。

1.2.4 游离酚的提取

游离酚的提取参考Guo[18]等人的方法，样品于-20 ℃储存备用。

1.2.5 结合酚的提取

结合酚的提取参考Chen[10]等人的碱水解法，样品于-20 ℃储存备用。

1.2.6 总酚含量测定

总酚含量的测定采用福林酚比色法[19]。以没食子酸为标准品制作标准曲线，所有测定执行3次重复，结果以每克豆壳干样品中没食子酸当量(mg GAE/g DW)表示。

1.2.7 总黄酮含量测定

总黄酮含量的测定采用NaNO2-AlCl3法[20]。以儿茶素为标准品制作标准曲线，所有测定执行3次重复，结果以每克豆壳干样品中儿茶素当量(mg CAE/g DW)表示。

1.2.8 抗氧化能力测定

(1) DPPH自由基清除能力测定 参考Zhang[21]等人的方法，结果以每克豆壳干样品中Trolox当量(μmol TE/g DW)表示。

(2) ABTS自由基清除能力测定 参考Zhang[21]等人的方法，结果以每克豆壳干样品中Trolox当量(μmol TE/g DW)表示。

(3) 铁离子还原能力测定 参考Li[22]等人的方法并稍作修改。简单来说，10 μL豆壳多酚提取物与300 μL的Fe-TPTZ试剂反应，并在室温下反应5 min后于593 nm波长条件下测定吸光度值。以FeSO4为标准品制作标准曲线，所有测定执行3次重复，结果以每克豆壳干样品中FeSO4当量(mmol Fe/g DW)表示。

1.2.9 UPLC-ESI-QTOF-MS2鉴定酚类组成

参考Sun[19]等人的方法，稍作修改。具体实验条件如下：

液相色谱条件：采用ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(2.1×100 mm，1.8-Micron，Agilent.)。流动相由含0.1%甲酸的水溶液(A)和含0.1%甲酸的95%甲醇/5%乙腈(B)组成。溶剂梯度如下：0～5 min，5%～12%B；5～15 min，12%～23%B；15～30 min，23%～50%B；30～40 min，50%～80%B；40～42 min，80%～100%B；42～44.5 min，100%～0%。后运行6 min以重新平衡色谱柱。进样量10 μL，流速设置为0.3 mL·min-1，柱温控制在40℃。检测波长为280 nm。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，负离子模式，电压：175 v，一级质荷比100～1500，碰撞能量25v；自动MS/MS模式下扫描m·z-1100～1500，设置多级碰撞能量10,20,30,40,50 V。数据获取和加工的质谱软件为Qualitative Analysis 10.0。

1.3 数据处理与分析

所有实验重复3次，数据以平均值±标准偏差表示，采用Origin软件作图，并采用SPSS 20.0统计软件，通过单因素方差分析进行显著性差异分析(P<0.05)，并用Pearson法进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 豆壳基础成分分析

两种豆壳的基础营养成分含量见表1。红色小扁豆豆壳中粗脂肪含量高于绿色小扁豆豆壳，而灰分和粗蛋白含量均低于后者，结果差异均具有显著性(P<0.05)。两种豆壳中粗脂肪含量分别为1.03%±0.01%和0.81%±0.03%，低于文献报道的普通大豆豆壳的脂肪含量(约15 mg·g-1DW)[23]。两种豆壳中粗蛋白含量分别为18.66%±0.25%和20.42%±0.19%，高于文献报道的9.7%[24]，主要原因是豆壳脱壳过程会伴随破碎的子叶以及富含淀粉和蛋白质的面粉的产生[9]，使得样品中粗蛋白含量较高。这一现象在Wang[25]等人的研究中得到验证，该团队对小扁豆脱壳废弃物中的豆壳的蛋白质含量测定，发现其含量为27.6%，可能是由于小扁豆

表1 豆壳中基础营养成分含量

品质和脱壳工艺的差异。由此可知，小扁豆豆壳含有一定量的基础营养成分，可被用于食品原料来源。

2.2 豆壳油脂中脂肪酸组成

豆壳油脂脂肪酸组成见表2。在红色扁豆豆壳中检测到9种脂肪酸，绿色扁豆豆壳中检测到10种脂肪酸，两种豆壳中不饱和脂肪酸为主要成分，分别占85.85%和84.09%，其中单不饱和脂肪酸分别占20.81%和23.24%，多不饱和脂肪酸分别占65.04%和60.85%，亚油酸是豆壳中主要的多不饱和脂肪酸，占56.62%和51.16%，其次为油酸，分别占20.13%和22.2%。不饱和脂肪酸具有降低心血管疾病发病风险、维持人体正常生理功能的作用[26]，在饮食中添加豆壳有助于提高人体对不饱和脂肪酸的摄入量。结果表明，小扁豆豆壳富含不饱和脂肪酸，可作为食品组分发挥健康效应。

表2 豆壳油脂脂肪酸组成

2.3 豆壳游离氨基酸组成

游离氨基酸是以游离态存在的单个氨基酸分子，可被直接吸收利用。豆壳中游离氨基酸组成见表3。两种豆壳中的游离氨基酸分布相似，精氨酸作为为条件性必需氨基酸，在两种豆壳中的含量最丰富，其次是丝氨酸和谷氨酸。两种豆壳必需氨基酸含量分别为84.11和115.11 mg·g-1DW，约占总氨基酸含量的17.39%和17.60%。除了亮氨酸、酪氨酸和赖氨酸外，两种豆壳的氨基酸成分均具有显著性差异(P<0.05)，绿色小扁豆豆壳含有更高的必需氨基酸和总氨基酸含量。结果表明，小扁豆豆壳富含必需氨基酸，可作为食品组分发挥健康效应。

表3 豆壳中游离氨基酸组成

2.4 豆壳中总酚、总黄酮含量

豆壳中不同酚类组分的总酚、总黄酮含量见表4。两种豆壳游离态总酚含量分别为(8.32±0.24)和(12.75±0.12) mg GAE/g DW，高于结合态的总酚含量((3.68±0.05)和(4.30±0.10) mg GAE/g DW)，总黄酮含量分别为(5.28±0.49)和(8.44±0.23) mg CAE/g DW，高于结合态总黄酮含量((2.87±0.05)和(3.62±0.13) mg CAE/g DW)。红色小扁豆豆壳在不同组分中的总酚、总黄酮含量均低于绿色小扁豆豆壳。而相较于其他植物性加工废弃物原料如红松壳(4.05 mg·g-1DW)[27]、榴莲壳(1.86 mg·g-1DW)[28]，豆壳具有更高的酚类含量，可作为功能性食品的原料。

表4 豆壳中总酚、总黄酮含量

2.5 豆壳酚类物质抗氧化能力

豆壳酚类物质的DPPH、ABTS自由基清除能力和总还原能力FRAP结果见图1。绿色小扁豆豆壳游离酚组分抗氧化能力高于红色小扁豆豆壳，且两种豆壳中游离态多酚抗氧化能力均高于结合态多酚(P<0.05)，表明豆壳多酚具有很强的抗氧化活性，可作为食品中抗氧化剂的来源。

(A)DPPH清除能力；(B)ABTS自由基清除能力；(C)铁离子还原能力。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.6 多酚、黄酮含量与抗氧化能力之间的相关性

由表5可知，两种豆壳多酚、黄酮含量与3种抗氧化能力之间均存在显著正相关，且ABTS、FRAP与多酚含量间呈现极显著正相关(R2>0.99)，此结果与刘仙俊[29]等人发现一致，说明豆壳的抗氧化能力主要与多酚含量有关，并且与多酚化合物种类和结构存在一定关系。此外，朱昱琳[30]等人研究发现长黑青稞的多酚含量与3种抗氧化能力之间均存在显著正相关(R2=0.998,0.935和0.966)。Baojun Xu[31]等人研究发现扁豆DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力FRAP主要和酚酸类物质有关(P<0.05)。

表5 豆壳多酚含量与抗氧化能力的相关性

2.7 豆壳酚类化合物组成

豆壳游离酚和结合酚的鉴定结果如图2和表6所示，共鉴定出12种游离酚和9种结合酚。具体结果如下：

表6 豆壳中游离酚、结合酚物质鉴定

图2 豆壳游离酚(A)、结合酚(B)280 nm波长处的DAD图

在游离酚组分中，化合物1的质荷比为m·z-1169.0120，其二级图谱如图3(A)所示，主要离子碎片为m·z-1125.0236，推测为失去一分子CO2形成，根据参考文献[8]该物质被鉴定为没食子酸。化合物2分子离子为m·z-1305.0671，其主要离子碎片在m·z-1139.0388和m·z-1125.0238，通过与Massbank数据库比对，初步判定其为没食子酰儿茶素[32]。化合物3，4，5，8为4种低聚原花青素物质，化合物3分子离子峰为m·z-1593.1285，其主要碎片离子峰包括m·z-1407.0755，m·z-1289.0713和m·z-1125.0238，其中最强离子峰为m·z-1289.0713(去质子化表/儿茶素特征峰)，根据文献报道[33]，初步鉴定为原飞燕草素二聚体；同理，化合物4和8为两种B型原花青素二聚体，其二级图谱见图3(B)，化合物5的分子离子峰为m·z-1865.1956，其主要碎片离子为m·z-1577.1351和m·z-1289.0697，表明该物质由黄烷醇二聚体和单体构成，因此判定为原花青素三聚体。化合物6分子离子峰为m·z-1451.1256，主要离子碎片包括m·z-1137.0239和m·z-1125.0239，其可能的裂解规律见图3(C)，初步鉴定其为儿茶素葡萄糖苷[19]。化合物7分子离子峰为m·z-1163.0397，其片段离子为m·z-1119.0500，为失去一分子CO2后形成，对比文献初步鉴定为对香豆酸[19]。化合物9分子离子为m·z-1193.0503，主要离子峰为m·z-1178.0263([M-H-CH3]-)，m·z-1134.0367([M-H-CH3-CO2]-)，通过与Massbank数据库比对，判定该物质为阿魏酸[32]。化合物10分子离子峰为m·z-1901.2608，主要离子峰为m·z-1755.2032，可能是脱去一分子脱氧己糖后形成，根据文献报道，初步判定该物质为山奈酚四葡萄糖苷化合物[21]；同理，化合物11分子离子峰为m·z-11047.2970，主要碎片离子峰为m·z-1901.2382，m·z-1755.1993和m·z-1284.0314，可能是该物质连续脱去一分子脱氧己糖后形成，初步鉴定该物质为山奈酚糖苷衍生物[34]。化合物12(m·z-1=447.0923)的二级图谱见图3(D)，在m·z-1285.0397处产生了碎片离子峰，推测是由于糖苷键裂解形成，初步鉴定为木犀草素糖苷[20]。

(A)没食子酸;(B)原花青素二聚体;(C)儿茶素葡萄糖苷;(D)木樨草素葡萄糖苷

在结合酚组分中，化合物1，3，6的分子离子峰均为m·z-1137.0235，且含有主要离子碎片m·z-1109.0292，推测为失去一分子CO形成，初步判定三种物质均为对羟基苯甲酸衍生物[19]。化合物2和5分子离子峰为m·z-1153.0191，主要离子碎片为m·z-1125.0239，m·z-1109.0293，推测分别为失去一分子CO和CO2后形成，初步判断该物质为二羟基肉桂酸衍生物，化合物4的分子离子峰为m·z-1289.0720，对比参考文献[19]中的出峰时间和Massbank数据库[32]中裂解规律，初步判定该物质为儿茶素。

多酚的抗氧化能力主要与其B环上的羟基取代基个数、位置以及聚合度有关。研究表明，在酚酸类物质中，含有三个邻位酚羟基的化合物抗氧化能力明显强于只含有两个或一个酚羟基的化合物，含有邻位酚羟基的化合物抗氧化能力强于含有间位酚羟基化合物[35]，本实验中游离酚组分含有没食子酸(3,4,5-三羟基苯甲酸)，其抗氧化能力强于结合酚中的对羟基苯甲酸衍生物和二羟基肉桂酸衍生物。同时，游离酚组分中还存在四种低聚原花色素，刘彦霞[36]等人发现在一定范围内，低聚原花色素的抗氧化能力随聚合度的增大而增强，这也可能是导致游离酚抗氧化能力强的原因。综上所述，小扁豆豆壳中除含有丰富的游离态多酚外，还含有具有较高活性的结合态多酚，其可能被体内消化酶和肠道微生物进一步利用，并释放出来，提高其健康效益。

3 结论

本研究首先对两种小扁豆壳的主要营养成分进行了分析，发现其含有较高的粗蛋白、不饱和脂肪酸和多种人体必需氨基酸。而对豆壳中游离态和结合态多酚进行进一步研究发现，两种豆壳均含有丰富的酚类成分，且无论是游离态还是结合态多酚的含量均与其抗氧化能力呈显著正相关。据报道，多酚的抗氧化能力主要与其B环上的羟基取代基个数、位置以及聚合度有关，通过UPLC-ESI-QTOF-MS2对豆壳中游离和结合酚组成进行结构表征，发现游离酚中主要含有羟基苯甲酸、羟基肉桂酸、黄酮类化合物及其糖苷化合物，结合酚中主要含有羟基苯甲酸、二羟基苯甲酸、黄酮类及其糖苷化合物。综上所述，小扁豆豆壳作为食品加工副产物具有丰富的酚类成分，本研究的结果为进一步开发和应用小扁豆豆壳提供了科学依据。