双组分植物精油/凹凸棒石杂化材料的制备及其抗菌活性*

钟火清,闫盆吉,牟 斌,杨芳芳,惠爱平,王爱勤

(1.中国科学院兰州化学物理研究所 甘肃省黏土矿物应用研究重点实验室,兰州730000；2.中国科学院大学 材料科学与光电子工程中心，北京 100049；3.中国科学院兰州化学物理研究所 盱眙凹土应用技术研发中心，江苏 盱眙 211700；4.河西学院 化学化工学院，甘肃 张掖 734000)

0 引 言

香芹酚(Carvacrol，CAR)是一种来源于百里香精油的酚类化合物，具有优异的抗菌活性与抗氧化性能，对哺乳动物细胞没有毒性，已经被美国食品药品监督管理局认定为安全的食品添加剂[1-4]。但由于挥发性强和水溶性差等缺点，大幅降低了生物利用率、抗菌活性和抗氧化性能，制约了在相关领域的广泛应用。为了改善CAR的环境稳定性，目前常用的方法包括纳米乳[5]、蛋白纳米颗粒[6]和环糊精包覆[7]等，但存在成本较高和制备工艺较繁琐等不足。

凹凸棒石(attapulgite,APT)是一种含水富镁铝硅酸盐黏土矿物，集一维纳米棒晶(棒晶长约0.5～5 μm，直径约20～70 nm)、规整孔道(0.37 nm×0.64 nm)、结构负电荷和硅羟基于一体，可用于构筑各种纳米功能复合材料[8-10]。Lei等[11]用APT负载姜精油，显著改善了精油稳定性。在前期研究中，我们采用机械力化学法以APT为载体制备了CAR/APT杂化抗菌材料[12]。研究表明，部分CAR分子进入APT孔道，形成了稳定的杂化体系，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度达到2.0 mg/mL，但与现有抗菌材料相比，抗菌活性还有待提升。

众所周知，不同精油分子具有不同的结构和理化性能，对细菌的作用方式也不尽相同。研究表明，基于不同精油分子之间的协同效应，通过不同精油分子的组合，可以明显增强精油分子的抗菌效果[13-16]。例如，伞花烃单独使用时没有表现出明显的抗菌活性，但与CAR协同后显著提升了抗菌活性[4,17]。为此，在系统开展CAR/APT杂化材料研究工作基础上[12]，本研究利用不同精油活性成分的协同抗菌效应，通过机械力化学法构筑了6种双组分植物精油/APT杂化抗菌材料(图1)，涉及的不同植物精油包括百里香酚(THY)[5]、香芹酮(CAV)[18]、薄荷醇(MEN)[19]、伞花烃(CYM)[17]、柠檬烯(LIM)[4]和萜品烯(TER)[4]。系统研究了杂化材料的结构、热稳定性及其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性，为发展新型抗菌材料奠定了应用基础。

图1 (a)CAR、THY、CAV、MEN、CYM、LIM和TER植物精油分子的结构图和(b)APT、CAR/APT及双组分植物精油/APT杂化材料的数码照片Fig 1 Molecular structure of CAR,THY,CAV,MEN,CYM,LIM and TER,and digital photograph of APT,CAR/APT and bi-component EOs/APT hybrid materials

1 实验部分

1.1 材 料

APT来自江苏玖川纳米材料有限公司，XRF测定化学组成为CaO (1.24%)、Al2O3(8.03%)、Na2O (1.51%)、MgO (12.65%)、SiO2(59.18%)、K2O (0.95%)和Fe2O3(5.07%)。CAR (99%)和THY(99%)购买自上海麦克林生化科技有限公司，MEN (98%)、CAV (98%)、CYM (97%)和LIM (97%)购买自阿法埃莎(中国)化学有限公司，TER (98%)购买自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。金黄色葡萄球菌(S.aureus,ATCC25912)和大肠杆菌(E.coli,ATCC25922)由兰州大学第二医院提供，营养琼脂培养基(NA)购买自青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.2 双组分植物精油/APT杂化抗菌材料的制备

分别将6种不同精油活性成分与CAR混合得到混合精油，在前期抗菌性能测试筛选下，CAR与不同植物精油的质量比为4∶1。分别将1.5 g混合精油与5.0 g APT拌合均匀，密封后置于黑暗处放置24 h，然后采用研磨仪(CRINOER,MG100)在60 rpm转速下研磨30 min。根据混合精油的活性成分的名称，将制得样品分别标记为THY/CAR/APT、CAV/CAR/APT、MEN/CAR/APT、CYM/CAR/APT、LIM/CAR/APT和TER/CAR/APT。

1.3 表 征

傅立叶红外光谱仪(FTIR)：Thermo Nicolet NEXUS TM spectrophotometer 6700型(美国)，样品经光谱纯 KBr 压片后在扫描波长400～4 000 cm-1范围内测试；热重分析仪(TG)：STA449 C TG-DSC型(德国)，测试温度为35～750 ℃，氮气气氛，升温速率为10 ℃/min。

1.4 抗菌试验

参照美国临床和实验室标准协会指导的琼脂稀释法[12]，通过测定材料对S.aureus和E.coli的最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)来评价杂化材料的抗菌性能。具体相关操作如下所述，取-80 ℃保存的标准菌种，接种至L-B肉汤中进行复活，当细菌传代进入对数期时，制备标准菌株菌悬液，调整菌悬液至0.5 McFarland标准浊度，稀释至107CFU/mL后备用；将20 mL高压灭菌后的NA与紫外线灭菌后的样品混合均匀，倒入灭菌后的培养皿中，冷却后即得含有抗菌样品的琼脂平板。用移液枪取1 μL稀释后的菌悬液，点种于琼脂平板上3个不同的位置，干燥后将琼脂平板置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察细菌生长情况，能完全抑制细菌菌落生长的最低样品浓度即为MIC。同时设置不加样品的琼脂平板为阳性对照。每个样本每个浓度下重复两次操作。

1.5 计 算

基于密度泛函理论(Density Functional Theory,DFT)通过Gaussian 09[20]计算软件在B3LYP-(D3BJ)/6-31G(d)水平下优化得到APT计算模型、吸附物以及吸附复合物的几何结构，为了得到更为精确的吉布斯自由能热力学数据，对稳定结构在M062X(D3)/def2-TZVP水平下进行单点计算[21]，计算吉布斯自由能GBS2 =GBS1-EBS1+EBS2 (其中G是吉布斯自由能，E是电子能,BS1指B3LYP-(D3BJ)/6-31G(d)水平，BS2指M06-2X(D3)/def2-TZVP计算水平)。基于分子中的原子量子理论(quantum theory of atom in molecular ,QTAIM)，利用Mu1tiwfn3.7[22]波函数分析软件及其独立梯度模型(Independent Gradient Model,IGM)考察复合物中氢键相互作用。所有的可视化图形都是利用GaussianView 6.0[23]和VMD1.0[24]可视化绘图软件。

2 结果与分析

2.1 杂化材料红外光谱分析

图2为APT、CAR/APT和双组分植物精油/APT杂化材料的FTIR谱图。在APT的红外光谱图中，3 548 cm-1处的吸收峰属于孔道内八面体边缘镁离子配位水的伸缩振动，3 421和1 654 cm-1处的吸收峰分别属于沸石水和表面吸附水伸缩振动和反对称伸缩振动[25]。在CAR/APT杂化材料的红外光谱图中，2 962 cm-1处的吸收峰来源于精油分子中-CH2的反对称伸缩振动，1 459和1 423 cm-1处的吸收峰来源于其分子结构中苯环C=C的伸缩振动[12]。这些特征吸收峰的出现，表明CAR成功负载到APT上。比较CAR/APT和双组分植物精油/APT杂化材料的红外谱图，没有明显区别，这主要归因于植物精油分子较为相似的分子结构。

图2 APT、CAR/APT和双组分植物精油/APT杂化材料的红外光谱Fig 2 FTIR of APT,CAR/APT and bi-component EOs/APT hybrid materials

加入精油分子不会影响凹凸棒石的结构[26]，但机械力研磨可使精油分子与APT孔道沸石水和八面体边缘的配位水发生相互作用[12]，从而引起APT位于3 548、3 421和1 654 cm-1处特征吸收峰发生偏移。因此，对比分析了负载植物精油前后这3个吸收峰位置的变化。如表1所示，对于CAR/APT，仅仅在3 548和3 421 cm-1处有2个波数的偏移，但形成双组分植物精油/APT杂化材料后波数偏移相对较为明显。在1 654 cm-1处的吸收峰均发生了红移，并且除CAV/CAR/APT位移较小外，其它5个杂化材料的波数位移都大于6；对于3 421 cm-1处的吸收峰，除TER/CAR/APT发生4个波数的蓝移外，其余均发生红移现象，且CAV/CAR/APT、MEN/CAR/APT和LIM/CAR/APT的红移现象都较为明显。相比之下，位于3 548 cm-1处的吸收峰偏移较小，CYM/CAR/APT几乎没有发生位移，TER/CAR/APT发生4个波数红移，其余都呈现蓝移现象。这表明双组分精油体系与APT的相互作用强于CAR与APT之间的作用。

表1 双组分植物精油/APT杂化材料在3 548、3 421和1 654 cm-1处的位移情况Table 1 Absorption peak shift of EOs/APT hybrid materials at 3 548/cm,3 421/cm and 1 654/cm

2.2 杂化材料热性能分析

图3给出了双组分植物精油/APT杂化材料的TGA及DTG曲线。APT在200 ℃以下出现了两个吸热峰，分别在75和180 ℃附近[12]，其中75 ℃附近的失重峰归因于表面吸附水的脱除，180 ℃附近的吸热峰归因于孔道内沸石水的脱除[27-28]。前期研究结果表明，CAR/APT在200 ℃以下只在135 ℃出现了一个吸热峰[12]，主要是杂化材料制备过程中研磨置换了APT的吸附水和沸石水。表2列出了双组分精油与APT形成杂化材料后的吸热峰温度和失重率。由表中数据可见，混合MEN、THY、CAV和CYM后，相应杂化材料的吸热峰温度分别升高至141、140、138和138 ℃；但混合LIM和TER后，相应杂化材料的吸热峰温度分别降为125和133 ℃。同时，引入LIM和TER制得杂化材料的失重率也较低，说明加入THY、CAV、MEN和CYM可以协同提高杂化材料的稳定性。

图3 (a)THY/CAR/APT,(b)CAV/CAR/APT,(c)MEN/CAR/APT,(d)CYM/CAR/APT,(e)LIM/CAR/APT和(f)TER/CAR/APT杂化材料的TGA和DTG曲线Fig 3 TGA and DTG cures of bi-component EOs/APT hybrid materials:(a)THY/CAR/APT;(b)CAV/CAR/APT;(c)MEN/CAR/APT;(d)CYM/CAR/APT;(e)LIM/CAR/APT and (f)TER/CAR/APT

表2 CAR/APT和双组分植物精油/APT杂化材料的吸热峰温度及失重率Table 2 Endothermic peak and mass loss of CAR/APT and bi-component EOs/APT hybrid materials

2.3 杂化材料稳定机理

杂化材料的稳定性与植物精油分子的结构有明显相关性。由图1a各种植物精油分子的结构图可见，THY、CAV、MEN和CYM分子中有含氧官能团或者苯环，而LIM和TER分子中既没有含氧官能团也没有苯环。研究结果表明，CAR、THY、CAV和MEN分子中的含氧官能团可与APT表面的Si-OH及孔道边的Mg-OH2基团形成较强的氢键，且不同的分子结构与两个基团形成氢键的强度不同[26]，所以植物精油分子结构中含有氧官能团及苯环可提升杂化材料稳定性。此外，植物精油分子也可能与CAR分子产生相互作用，如氢键和π-π作用，从而有助于提高杂化材料的稳定性。因此，加入THY、CAV、MEN和CYM后稳定性提高的原因可归因于不同精油分子之间的相互作用，或者是与APT作用位点的差异。

为了进一步明晰加入THY、CAV、MEN和CYM分子后杂化材料稳定性提高的原因，计算模拟了这几种分子与CAR分子相互作用情况。计算以CAR/APT复合物为底物，由图4可见，CAR 与其它植物精油分子之间存在氢键等弱相互作用力。CAR 与CAV、THY 和MEN之间主要存在O-H…O之间的氢键，这从IGM图上可以清晰的表现出来，分子之间绿色片状区域中的蓝色部分表示氢键作用力，说明CAV/CAR、MEN/CAR 和THY/CAR 之间的弱相互作用力以氢键为主。通过吉布斯自由能数据可知(图5)，该过程分别需要吸热2.25、2.38和1.83 kcal/mol，但与TER、LIM和 CYM分子之间，虽然也有氢键作用力存在，但主要以范德华力为主，在热力学上表现为吸热更多，需要吸热3.83、3.66和4.29 kcal/mol。对比前期对这些精油分子与APT相互作用的数据[26]，发现APT与精油分子之间的作用力远强于CAR与其它分子间的作用力，所以加入THY、CAV、MEN和CYM后杂化材料稳定性提高的原因主要是精油分子与APT不同位点之间作用强度差异引起的。

图4 精油分子复合结构及IGM分析分子间氢键相互作用力,其中δginter =0.05 a.u.Fig 4 Structure of bi-component EOs molecules and intermolecular hydrogen bond (δginter =0.05 a.u.)

图5 混合精油分子的吉布斯自由能Fig 5 Gibbs free energy of mixed EOs molecules

2.4 抗菌性能

CAR和THY都是具有良好抗菌效果的精油分子，研究结果表明，CAR/APT和THY/APT对E.coli和S.aureus的MIC都为2.0 mg/mL[12,26]，而其它精油分子单独使用时抗菌效果较差[4]。根据文献报道，不同精油分子之间的协同作用可以提升单一精油分子的抗菌活性[13-16]。图6给出了双组分植物精油/APT杂化材料对E.coli和S.aureus的MIC值。从表中MIC值可见，与CAR/APT的MIC值相比，除MEN/CAR/APT外，其它杂化材料对E.coli的MIC都降低到了1.0 mg/mL；除LIM/CAR/APT外，其它杂化材料对S.aureus的MIC值都降低到了0.5 mg/mL。由此可知，其它精油成分的引入都明显增强了CAR/APT的抗菌性能，表明这几种精油分子能与CAR产生协同作用。对于协同作用机理，除了不同精油分子与细菌之间作用方式外，不同精油分子与APT的作用位点是一个重要因素。

图6 双组分植物精油/APT杂化材料对E. coli和S. aureus的MIC：(a)THY/CAR/APT,(b)CAV/CAR/APT,(c)MEN/CAR/APT,(d)CYM/CAR/APT,(e)LIM/CAR/APT 和(f)TER/CAR/APTFig 6 MIC values of bi-component EOs/APT hybrid materials against E. coli and S. aureus:(a)THY/CAR/APT;(b)CAV/CAR/APT;(c)MEN/CAR/APT;(d)CYM/CAR/APT;(e)LIM/CAR/APT and (f)TER/CAR/APT

3 结 论

(1)在APT上同时引入CAR和THY、CAV、MEN、CYM精油分子可以改善杂化材料的热稳定性。对于有含氧官能团的THY、CAV和MEN，提高杂化材料热稳定性的原因是本身与APT能形成较强的氢键，而CYM与CAR分子之间存在π-π相互作用。

(2)引入不同植物精油分子也有助于提高杂化材料的抗菌活性，除MEN和LIM外，其它双组分植物精油杂化材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为1.0 mg/mL和0.5 mg/mL。抗菌活性的提升与精油分子间的协同效应密切相关。