不同陈酿时间下郫县豆瓣挥发性风味化合物及标志性风味成分解析

谭馨怡，卢云浩，任尧，何强，迟原龙

(四川大学 轻工科学与工程学院，成都 610065)

郫县豆瓣是川味中必不可少的一味发酵调味品，被誉为“川菜之魂”[1]。郫县豆瓣独特的香气构成与其传统的“翻晒露”工艺和一定时间的陈酿过程密不可分[2-3]。近年来，郫县豆瓣的风味特性及其形成机理已引起较多关注。邓维琴等发现长时间的陈酿过程有助于丁酸、2-甲基-戊酯、2-哌啶酮等风味化合物的形成[4]。林洪斌等研究了郫县豆瓣中特征香气成分的形成机制，认为四甲基吡嗪主要形成于蚕豆发酵阶段，而4-乙基苯酚和4-乙基-2-甲氧基苯酚产生于辣椒发酵阶段[5]。Lu等报道郫县豆瓣酯香型风味主要来源于乙酯类物质，而吡嗪和呋喃酮类化合物是其酱香型风味的物质基础[6]。尽管如此，陈酿时间作为影响郫县豆瓣香气形成的重要因素，其对豆瓣挥发性风味化合物及标志性风味成分的影响至今仍不清楚。基于此，本文以不同陈酿时间的郫县豆瓣为研究对象，考察了陈酿时间对其氨基酸态氮、总酸和色度的影响，利用GC-MS分析了不同陈酿时间下郫县豆瓣的挥发性化合物构成及其含量，以及主要挥发性风味物质及其香气。在此基础上，利用偏最小二乘判别分析确定不同陈酿时间下郫县豆瓣的标志性风味成分。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

陈酿时间为3，6，9，12，29，36个月的郫县豆瓣酱：采集自四川成都某豆瓣酱生产厂家，样品采集后于-18 ℃保存。正构烷烃标准品(C7～C30)和庚酸甲酯：购于上海西格玛公司；甲醛(36%)、氢氧化钠等化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Color reader CR-20色度计 日本柯尼卡-美能达公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取装置 美国Supelco公司；QP2010型气质联用仪 日本岛津公司；DB-5MS气相色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 美国安捷伦公司。

1.3 实验方法

1.3.1 氨基酸态氮、总酸含量及色度的测定

氨基酸态氮和总酸含量分别依据国家标准GB 5009.235-2016和GB/T 5009.40-2003中的方法进行测定。称量100 g样品于无色透明平皿中并压实，采用色度计测量样品表面6个位置的色度值(L*、a*和b*)。

1.3.2 GC-MS分析及挥发性风味化合物的确定

样品的萃取和气质测试条件参考Lu等所报道的方法[7]。在5 g研磨样品中加入20 μL庚酸甲酯(样品中浓度为200 μg/kg)作为内标物定量。样品于50 ℃孵育10 min，固相吸附30 min后进行GC-MS分析，解吸5 min。色谱条件：40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升温至150 ℃，再以6 ℃/min升温至240 ℃并保持10 min。接口温度250 ℃，传输线和离子源温度230 ℃。质谱条件：以氦气为载气，流速1 mL/min，不分流模式。MS扫描范围为35～400 m/z，电离电压为350 V，电子碰撞电离能量为70 eV。对在NIST 14/NIST 14s标准质谱数据库中匹配度>80且保留指数(RI)与文献报道RI间差值≤30的挥发性化合物进行确认，并采用内标法对鉴定到的化合物进行定量，单位为μg/kg。通过文献查阅确定化合物的气味特性及其阈值，并由物质含量与其阈值之比计算每种气味物质的OAV，将OAV>1的物质认定为样品中的挥发性风味化合物。

1.3.3 不同陈酿时间下郫县豆瓣标志性风味成分的确定

将1.3.2中确定的挥发性风味化合物作为自变量x，以某一陈酿时间下样品的香气构成作为因变量y，利用SIMCA中偏最小二乘判别分析(PLS-DA)建立两者间的内在联系。通过计算比较挥发性化合物重要性指数VIP值，确定不同陈酿时间下郫县豆瓣的标志性风味成分。VIP值可以反映自变量x对因变量y的重要性，其计算公式如下。

式中：p为自变量个数，th为矩阵T的第h列分量，Y为一组因变量(y1，y2，……，yq)构成的数据表Y=(yij)n×j，Rd(Y;th)为提取第h个主元对Y的贡献值，whi为自变量x在主成分上的权重[8-9]。

1.4 数据分析

所有测试平行进行3次，结果表示为平均值±标准方差。使用SPSS 22.0进行最小显著性差异与邓肯多重检验，显著性水平p<0.05。采用SIMCA 14.1、Origin 9进行PLS-DA分析、聚类分析及图表制作。

2 结果与讨论

2.1 陈酿时间对郫县豆瓣总酸、氨基酸态氮和色度的影响

氨基酸态氮和总酸含量是表征郫县豆瓣风味的重要指标。通常情况下，郫县豆瓣的氨基酸态氮含量越高，其风味品质越好[10]。随着陈酿时间的增加，豆瓣样品的总酸和氨基酸态氮含量均呈现逐渐升高趋势。当陈酿时间达到12个月及以上时，其氨基酸态氮含量高于0.25 g/100 g，达到特级郫县豆瓣标准，见表1。此外，不同陈酿时间下样品的氨基酸态氮含量间均存在显著差异，表明氨基酸类风味物质随着陈酿时间的延长而快速累积。陈酿3～12个月、样品的总酸含量间无显著差异。色度也是郫县豆瓣主要的感官指标之一，直接影响消费者的购买意愿。样品的明度值(L*)、红度值(a*)和黄度值(b*)均随着陈酿时间的增加而降低，表明豆瓣样品的色度由红棕色逐渐变为暗褐色，这可能与豆瓣陈酿过程中美拉德反应加剧有关[11]。

表1 不同陈酿时间下郫县豆瓣的总酸、氨基酸态氮含量和色度Table 1 The content of total acid, amino acid nitrogen and chroma of Pixian bean paste at various aging time

2.2 陈酿时间对郫县豆瓣挥发性化合物种类和含量的影响

郫县豆瓣中含有多种挥发性成分，包括酯类、醇类、酸类、醛类、酮类、酚类、吡嗪类、吡咯类、呋喃类和其他类化合物。不同陈酿时间郫县豆瓣挥发性化合物的种类和含量呈现不同的变化规律，见图1。在挥发性化合物种类和构成方面，当陈酿时间为3～12个月时，豆瓣样品含有挥发性化合物67～88种，其中酯类和醇类为主要组成成分；当陈酿时间延长至29～36个月时，样品中挥发性化合物种类增至100种以上，酯类、醇类和醛类为主要成分，且其他类物质种类大幅提升。郫县豆瓣在较长时间的陈酿过程中发生复杂的化学反应，如蛋白质降解、羰氨反应、酚类氧化、羟醛缩合等[12]。这些物质间转化将有助于提升样品中挥发性化合物的种类，可能赋予郫县豆瓣更加丰富饱满的风味，这与罗静等的研究结果相吻合[13]。在挥发性化合物含量方面，豆瓣样品在陈酿3～12个月时挥发性化合物总含量均达到6000 μg/kg以上。当陈酿时间延长至29～36个月时，其总含量仅为4000 μg/kg左右。这可能是由于：一些挥发性较强的化合物在豆瓣长期的开放式陈酿过程中逐渐损失；一些结构简单的挥发性酯类、醇类、酚类等物质逐渐转化为结构复杂且挥发性较弱的化合物，如高级脂肪酸酯、吡嗪和呋喃类化合物。

图1 不同陈酿时间下郫县豆瓣挥发性化合物的种类(A)及含量(B)Fig.1 The types (A) and content (B) of volatile compounds from Pixian bean paste at various aging time

2.3 陈酿时间对郫县豆瓣挥发性风味化合物的影响

郫县豆瓣中共确定24种挥发性风味化合物(OAV>1)，包括8种酯类、5种醇类、5种醛类、2种酮类、3种酚类和1种烯烃。癸酸甲酯、3-甲基丁醇、芳樟醇和苯乙醛是郫县豆瓣的主要挥发性风味化合物，赋予其花果香、油脂香和蜂蜜香，见表2。陈酿3～12个月的样品中酯类和醇类挥发性风味物质为8～10种，醛类、酮类、酚类及其他类物质为4～6种，而陈酿29～36个月的样品中醛类、酮类、酚类及其他类风味物质增加至8种，醇类和酯类物质为6种，表明郫县豆瓣的风味构型随着陈酿时间的延长而产生一定程度的变化。辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯和3-甲基-丁酸乙酯是陈酿3～12个月豆瓣特有的主要挥发性风味物质，使陈酿时间较短的豆瓣有较强的花果基底香气。3-辛烯醇、反式壬烯醛和癸醛是陈酿29～36个月豆瓣特有的主要风味化合物，赋予长时陈酿郫县豆瓣以板栗、黄瓜和橙皮等复合香气。

表2 不同陈酿时间下郫县豆瓣挥发性风味化合物Table 2 The volatile flavor compounds of Pixian bean paste at various aging time

2.4 不同陈酿时间下郫县豆瓣标志性风味成分分析

采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)探讨郫县豆瓣中24种挥发性风味化合物与陈酿时间的内在联系，进而确定不同陈酿时间下郫县豆瓣的标志性风味成分。由PLS-DA的主成分提取和聚类分析可知，陈酿29～36个月豆瓣样品的风味物质明显区别于陈酿时间为3～12个月的样品，见图2中A和B。依据风味物质对不同陈酿时间下豆瓣样品香气的贡献度(VIP值)，确定陈酿3～12个月豆瓣的标志性风味物质为辛酸乙酯和4-乙基-愈创木酚，而陈酿29～36个月的豆瓣为反式-壬烯醛，见表3。

图2 不同陈酿时间下郫县豆瓣挥发性风味化合物PLS-DA得分图(A)和聚类分析(B)Fig.2 PLS-DA scores (A) and clustering analysis (B) of volatile flavor compounds of Pixian bean paste at various aging time

表3 不同陈酿时间下郫县豆瓣主要挥发性风味化合物及其重要性指数Table 3 The main volatile flavor compounds of Pixian bean paste at various aging time and their importance indexes

3 结论

陈酿时间对郫县豆瓣的挥发性风味物质及其香气构成具有重要影响。随着陈酿时间的延长，郫县豆瓣的氨基酸态氮含量和挥发性化合物种类均显著增加。陈酿3～12个月的郫县豆瓣表现出较强的花果香气，标志性风味成分为辛酸乙酯和4-乙基-愈创木酚；陈酿29～36个月的豆瓣呈现板栗、黄瓜和橙皮等复合香气，标志性风味成分为反式-壬烯醛。本文可为传统发酵调味品的风味化学研究提供有价值的参考。