基于网络药理学和分子对接研究当归四逆吴茱萸生姜汤治疗雷诺综合征的机制

周志锋，郭会卿，曹玉举，赵晶晶，袁都户

（1.河南中医药大学，河南 郑州 450000；2.河南省中医院，河南 郑州 450000；3.郑州中医骨伤病医院，河南 郑州 450000）

0 引言

雷诺综合征(Raynaud’s syndrome,RS)是一种阵发性动脉痉挛性疾病[1]。发病率大约是5%，女性多于男性[2]，分为特发性和继发性两种[3]。西医治疗分为药物治疗和手术治疗，相关药物如钙通道阻滞剂(CCB)、磷酸二酯酶-5 抑制剂(PDE-5)、内皮素受体拮抗剂等，药物治疗无效者可行交感神经阻断术[4],然其远期疗效欠佳且复发率较高。

当归四逆加吴茱萸生姜汤出自《伤寒论》，具有温通血脉，祛除里寒的功效。现代药理学研究表明当归四逆吴茱萸生姜汤能促进外周血液循环,增加血流并改善末梢循环障碍[5]。广泛用于治疗宫寒不孕、月经后期[6]、雷诺氏病 (肢端动脉痉挛病)[7]、厥阴寒化证[8]等。本文通过网络药理学和分子对接方法对当归四逆吴茱萸生姜汤进行研究，从而探讨其治疗雷诺综合征的作用机制。

1 材料与方法

1.1 中药活性成分及相关靶点筛选

应用中药系统药理学分析平台（TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php)对当归四逆吴茱萸生姜汤（当归、桂枝、白芍、细辛、通草、大枣、吴茱萸、生姜）有效活性成分及其对应靶点进行筛选，筛选条件为口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（Druglike，DL）≥0.18。进一步应用人类蛋白质数据库(UniprotDatabase,https://www.uniprot.org/) 对各靶点人类基因简称进行查询。

1.2 本病相关靶点

以“Raynaud’s syndrome”为检索词，应用人类基因数据库（GeneCards,https://genealacart.genecards.org/)、在线《人类孟德尔遗传》数据库（OMIM,https://www.omim.org/）、药物基因组学知识库（PharmGkb，https://www.pharmgkb.org/)、药物和疾病数据库（DrugBank,https://go.drugbank.com/)进行检索，获得雷诺综合征相关靶点。

1.3 药物与疾病交集靶点筛选及“化合物-靶点”网络构建

利用R语言（https://www.r-project.org/）将化合物潜在靶点与疾病靶点取交集，获取当归四逆吴茱萸生姜汤治疗RS 的交集靶点。运用Cytoscape3.6.1（https://cytoscape.org/）绘制“活性成分-靶点”网络图，节点（node）分别代表药物、成分或靶点，边（edge）代表节点间的相互关系。在本研究中，网络中的节点与自由度（degree）值呈正相关，节点自由度值的大小决定了其在网络中的地位，从而说明其生物学重要性。

1.4 PPI 网络构建和核心靶标筛选

首先将交集基因上传至STRING 平台（https://string/db.org/）构建共同靶点PPI 网络，其中模式为“multiple proteins”，蛋白种属为“Home sapiens”，将0.4 作为最小互作分数值,其他参数保持默认,从而获得PPI 网络，构建PPI 网络模型，然后将其导入Cytoscape 3.6.1，通过插件CytoNCA对每个节点的打分进行计算，筛选出打分较高的节点并再次构建网络，最终得出PPI 网络中核心基因。

1.5 GO 和KEGG 富集分析

将交集靶点导入R 语言，并进行GO 和KEGG 通路富集分析。GO 富集分析由生物过程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）和细胞组分（Cellular component，CC）三个部分组成。将P<0.05 作为其筛选标准，从而富集分析结果进行可视化处理。

1.6 分子对接

为验证筛选出的当归四逆吴茱萸生姜汤治疗RS的可能关键靶点的准确性，将调控网络度值靠前的活性成分与PPI 网络拓扑得到的核心的靶点进行分子对接。通过PDB 蛋白数据库（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）下载核心靶点蛋白结构；通过PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载化合物结构。应用Autodock Vina软件进行分子对接，通过Pymol 软件对结果进行输出优化。

2 结果

2.1 当归四逆吴茱萸生姜汤有效成分及靶点

在TCMSP 中,符合筛选条件的有效成分共256 个，其中当归2 个，桂枝7 个，芍药13 个，生姜5 个，通草32 个，吴茱萸176 个，细辛8 个，大枣29 个。在Uniprot 数据库中找到对应基因名的靶点有211个（图1）。

2.2 当归四逆吴茱萸生姜汤治疗RS 作用靶点预测

通过检索genecards、omim、PharmGkb、Drug Bank 数据库删除重复值后得到1163 个疾病相关靶点。利用R 语言得到当归四逆吴茱萸生姜汤治疗RS的潜在基因86 个（图1）。

图1 当归四逆吴茱萸生姜汤与RS 共同靶点

2.3 “化合物-靶点”网络分析

将化合物、靶点输入Cytoscape 软件，构建“活性成分-靶点”网络（图2）。网络图中共有120 个节点，“Degree”值排名前4 的化合物分别是槲皮素、山柰酚、谷固千金藤啶碱、β-谷固醇（表1）。

表1 度值前10 的活性成分

图2 “有效成分-靶点”网络

2.4 PPI 网络构建和核心靶点筛选

将筛选得到的当归四逆吴茱萸生姜汤治疗RS 的86 个基因上传至String 数据库进行蛋白与蛋白的相互作用分析（图3），并保存CSV 文件。将CSV 文件导入Cytoscape3.6.1 软件并利用CytoNCA 插件进行拓扑分析，最终获取核心基因AKT1、JUN、CXCL8、TP53、VEGFA、CASP3、PTGS2、IL1B、MMP9（图4）。

图3 交集靶点PPI 网络图

图4 PPI 网络拓扑分析核心基因

2.5 生物过程及通路富集分析

通过R 语言对交集靶点进行GO 和KEGG 富集分析，分析发现，GO 富集分析主要涉及生物过程（BP）1777 个，细胞组分（CC）80 个，分子功能（MF）128 个（图5）；KEGG 通路富集分析共涉及136 条通络，主要包括AGE-RAGE 信号通络、TNF 信号通路、IL-17 信号通路等（图6）。提示当归四逆吴茱萸生姜汤可能通过这些通路发挥对RS 的治疗作用。

图5 交集靶点 GO 富集分析

图6 交集靶点 KEGG 通路富集分析

2.6 分子对接验证

选取核心基因排名靠前的AKT1、JUN、CXCL8、VEGFA、CASP3、PTGS2、IL1B 靶蛋白与度值排名前4的化合物（槲皮素、山柰酚、β-谷固醇、千金藤啶碱）进行分子对接（表2），选取最低结合能组合，使用Pymol 软件选取最低结合能进行绘图（图7）。最低结合能越低，靶蛋白与活性成分之间结合活性度越高，说明两者之间结合能力越好[9]。结果表明靶蛋白与主要有效成分具有较强的结合能力。

表2 主要化合物与主要靶点对接情况

图7 化学成分与靶点的分子对接图

3 讨论

雷诺病根据其临床表现,属于中医“厥证”范畴。《素问·厥论》指出：“气因于中,阳气衰,不能渗营其经络,阳气日损,阴气独在,故手足为之寒也。”因此,本病系阴寒内盛,肾阳虚衰,复被寒邪所中,内外合邪,血气运行不畅所致。当归四逆吴茱萸生姜汤中的当归、白勺养血活血通络，桂枝、细辛、吴茱萸、生姜温肾助阳逐寒，通草疏通血脉，全方共奏温经散寒、温阳通脉之效，临床用于治疗雷诺综合征疗效显著。

从调控网络得到槲皮素、山柰酚、β-谷固醇、千金藤啶碱等关键化合物。有相关证据表明，血管调控失衡与RS 密切相关[10-11]。槲皮素是一种常见的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗血栓形成等作用。可通过降低氧化应激信号通路、抑制细胞凋亡信号通路改善组织缺血再灌注损伤[12]。山奈酚能抑制TNF-a 和IL-6 等细胞因子的水平以及NF-kB 激活，保护血管免受氧化应激和炎症引起的损伤[13]。β-谷甾醇是一种安全的天然药物,具有抗炎、抑制肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗高血脂、镇痛等广泛的药理活性[14]。实验研究表明β-谷甾醇对血管细胞粘附分子1（VCAM-1）有明显的抑制作用，进而抑制血小板及血红蛋白聚集形成血栓[15]。肾上腺素能受体(AR)是一种神经纤维,其对温度极其敏感，可通过与其受体相结合从而发挥缩血管的作用[16]。研究发现，左旋千金藤啶碱(l-SPD)能阻断β 肾上腺素受体[17]，进而发挥治疗雷诺综合征的作用。

由蛋白相互作用网络可知AKT1、JUN、CXCL8、VEGFA、CASP3、PTGS2、IL1B 等9 个靶点是雷诺综合征互作网络中主要靶蛋白。血管内皮生长因子（VEGF)可以导致血管结构异常，并在RP 的发病机制中起着重要的作用[18]。AKT1（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）可以被多种上游细胞因子（如VEGF 等）激活，发挥保护缺血性损伤后的神经元的作用[19]。

在KEGG 分析的过程中，RS 与AGEs-RAGE 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、松弛素信号通路、HIF-1、NF-κB 信号通路密切相关。当NF-κB 被AGEs-RAGE 信号通路激活后,进入细胞核,在核内同多种基因启动子特异性序列结合,引起大量黏附分子、生长因子、促炎细胞因子(如IL-6、IL-8、IL-α)等的表达和释放,最终引起慢性细胞活化和组织损伤[20]，导致血浆粘度上升。RS 是以限制血液流向四肢造成缺氧为特征血管痉挛性疾病。由于缺氧反应途径的复杂性，抗缺血治疗仍然是一个挑战。低氧诱导因子(HIF)-1 是一种异质二聚体转录因子，在维持人体氧气稳态方面有重要作用[21]。HIF-1α的重要下游基因是血管内皮生长因子(VEGF),后者是一种低氧敏感基因,能够被HIF-1α 诱导上调,促进血管新生，从而发挥抗缺氧作用[22]。90%以上的系统性硬化征(systemic sclerosis,SSc) 病人以继发性RP 为首发症状，但其发病机制尚不清楚，目前临床以口服药物治疗为主,但效果不佳[23]。松弛素是一种众所周知的抗纤维化肽激素，能够激活多个信号传导通路，一方面通过抑制炎症和成纤维细胞活化，减少纤维化；另一方面，松弛素还能促进基质金属蛋白酶(MMPs)的表达和活性，促进异常胶原的降解，降低血浆纤维蛋白程度[24]。

分子对接表明配体和受体的结合能均≤-6 kcal·mol-1，结合位点均有稳定的氢键和疏水键，其构象稳定，其中β-谷固醇与AKT1 的结合（-10.6 kcal·mol-1）最为稳定。分子对接的结果说明，当归四逆吴茱萸生姜汤活性成分可以与受体蛋白稳定结合，从而起到治疗雷诺综合征的作用。

综上所述，在治疗雷诺综合征方面，当归四逆吴茱萸汤具有多靶点、多途径、多通路的特点。本文不仅为其临床应用提供了科学依据，同时为探索新的治疗方法提供思路。