基于RAD测序技术的瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachellii)微卫星标记的开发

王青云 郭稳杰 成为为 邓国乔 徐洪亮 夏儒龙

(1 武汉市农业科学院，武汉 430207；2 华中农业大学水产学院，武汉 430070)

瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrusvachellii)隶属于鲇形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、黄颡鱼属(Pelteobagrus)，是黄颡鱼属中个体最大、生长最快的类群，主要分布于长江及其支流中[1]。该鱼因肉质细嫩、味道鲜美、少肌间刺、营养价值高等优点而备受消费者的青睐[2]。但是近些年，由于生境恶化和过度捕捞等原因，瓦氏黄颡鱼野生资源遭到严重破坏，其种质资源也面临巨大威胁[3]。良种选育是我国瓦氏黄颡鱼养殖产业健康与可持续发展亟待解决的重要内容之一，而在良种选育过程中，对其遗传多样性和系谱信息的掌握是至关重要的。

微卫星标记(microsatellite)又称为简单序列重复(simple sequence repeats，SSR)，因具有共显性、多态性丰富、遵循孟德尔遗传、易于检测等优点，现已被广泛用于群体遗传学[4]、亲子鉴定[5]、遗传图谱构建[6]和基因定位研究[7]等领域。近年来，新一代高通量测序技术和生物信息学分析方法的发展，使得低廉且高效地获得SSR标记序列成为可能。目前已利用高通量测序技术对黄颡鱼 (Pelteobagrusfulvidraco)[8]、茎柔鱼(Dosidicusgigas)[9]、大刺鳅 (Mastacembelusarmatus)[10]等物种进行了SSR标记的开发。本研究采用RAD(restriction association site DNA)简化基因组测序技术开发瓦氏黄颡鱼的SSR标记，以期为瓦氏黄颡鱼分子标记辅助育种提供可用的分子标记。

1 材料和方法

1.1 瓦氏黄颡鱼样本采集

研究所用的30个瓦氏黄颡鱼样本全部采自长江武汉段，剪取部分鱼的尾鳍后将其放生，尾鳍样本用无水酒精固定后于-20 ℃冷冻保存备用。基因组DNA采用TIANGEN[天根生化科技(北京)有限公司]试剂盒提取。

1.2 RAD文库构建和测序

随机选取8个瓦氏黄颡鱼样本送交广州基迪奥生物科技有限公司构建RAD简化基因组文库，采用Illumina Hiseq 2500进行测序。

1.3 SSR位点鉴别

将8个样品的高质量测序数据进行聚类，拼接组装获得contig序列后，使用软件MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)对所有contig序列进行SSR鉴别，鉴别标准为2、3、4、5、6碱基的重复次数至少为6、5、4、4、4。

1.4 SSR引物设计与多态性筛选

鉴定出的SSR位点采用primer 3引物设计工具(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)进行批量设计。随机挑选25对SSR重复次数相对较多的引物由武汉天一辉远生物科技有限公司进行合成。

用8个瓦氏黄颡鱼DNA模板对合成引物进行初步筛选和条件优化，优化后的引物进行荧光标记后以30个个体DNA为模板进行PCR扩增，扩增后的PCR产物采用毛细管电泳进行多态性筛选。PCR反应体系包括：2×PCR Mix 10 μL，DNA模板1 μL(50 ng/μL)，5 mmol/L引物对各0.5 μL，超纯水8 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸40 s，循环34次；72 ℃延伸7 min。PCR产物送武汉天一辉远生物科技有限公司采用ABI 3730XL进行基因型分析。

1.5 数据统计及分析

根据统计的基因型数据，用PopGen 32软件[11]计算微卫星位点等位基因数(Na)；采用MS-TOOLS[12]分析观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)及多态信息含量 (polymorphic information content，PIC)；用ARLEQUIN version 3.1 软件[13]检测各位点是否偏离哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)。

2 结果

2.1 瓦氏黄颡鱼RAD简化基因组SSR分析

序列组装和拼接后共获得2 275 778条contig序列，利用MISA对所得的contig序列进行微卫星片段搜索，共检测到466 983个SSR位点，其中二碱基重复位点最多(335 095个)，主要是AC/GT(占49.8%)，其次是四碱基重复位点(84 703个)，主要是AATG/CATT(占3.9%)；剩余依次是三碱基重复位点(31 271个)、五碱基重复位点(13 661个)和六碱基重复位点(2 253个)。相关信息详见图1和表1。

图1 SSR重复单元分类和分布频率统计Fig.1 Characterization and frequency of microsatellites with different motif sizes

表1 微卫星重复类型统计表Tab.1 Statistics information of microsatellites with different motif sizes

2.2 瓦氏黄颡鱼SSRs多态性筛选和检测

本研究从被筛选出的结果中随机选取SSR重复次数相对较多的25对引物，对武汉江段8个瓦氏黄颡鱼DNA样本进行PCR扩增，经优化后，有19对引物能较好地扩增出产物，且产物大小与预期扩增目的片段大小一致。用30个瓦氏黄颡鱼样本对扩增出目标产物的引物进行多态性验证，其中13个位点呈现出多态性(见表2)。

表2 瓦氏黄颡鱼多态性微卫星引物序列信息Tab.2 Information of polymorphic microsatellite markers isolated from Pelteobagrus vachelli

13个位点共检测到184个等位基因，各位点等位基因数(Na)在11～21个，平均为14.2个；各位点观察杂合度(Ho)在0.700～1.00，平均为0.874；期望杂合度(He)在0.871～0.933，平均为0.905；平均多肽信息含量(PIC)为0.880，所有位点均属于高多态性位点(PIC>0.5)。除位点PV6和PV7显著偏离Hardy-Weinberg平衡(0.01

3 讨论

传统SSR开发方法往往需要构建基因组富集文库、杂交筛选和测序等步骤，过程比较耗时费力，如今高通量测序技术的飞速发展以及成本的急剧降低为SSR标记的开发创造了较好的条件，该技术具有开发周期短、得率高、灵活性好等优点[14]。近年来，利用RAD简化基因组测序开发SSR标记的技术日益成熟，相关研究报道也越来越多。刘连为等[9]对茎柔鱼(D.gigas)进行了RAD简化基因组测序，覆盖度为2X，结果表明，可进行引物设计的SSR位点有5 177个，在随机合成的100对引物中，有60对引物扩增出清晰条带，其中39对引物扩增出的条带呈现多态性。屈政委等[15]采用RAD-seq对印尼虎鱼(Datnioidespulcher)进行简化基因组测序，经序列分析，共检测到26 359个SSR位点，并成功开发出20个多态性的SSR位点。本研究通过分析瓦氏黄颡鱼RAD简化基因组测序数据，共鉴定出466 983个SSR位点，在此基础上，后续所要做的工作相对比较简单，只需要进行PCR扩增以检验其是否具有多态性即可。因此，基于RAD简化基因组测序进行SSR标记开发具有很好的应用前景。

目前已报道的瓦氏黄颡鱼SSR标记数量很少，均来自同属黄颡鱼的跨种扩增[16]，尚未见到基于高通量测序技术大量开发瓦氏黄颡鱼SSR标记的报道。本研究通过对瓦氏黄颡鱼RAD简化基因组序列进行分析，共设计出了414 484对符合引物开发条件的SSR候选引物。为了进一步检验引物的开发质量及开发效率，利用荧光PCR毛细管电泳对其中25对引物进行了电泳检测。检测结果表明，在25对引物中，有13对为多态性引物，且均为高多态性引物(PIC>0.5)[17]，这可能与选择的SSR重复次数相对较多有关。这13个具有高度多态性的位点今后可直接应用于瓦氏黄颡鱼群体遗传学、亲子鉴定、分子标记辅助育种等方面研究中。