白芷乙素对溃疡性结肠炎小鼠的影响

宋少华，李海舰，李莉娟，方晓琳

（广东省第二人民医院检验医学部，广东广州 510317）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）是一种比较常见的炎症性疾病，临床上UC患者常表现为腹胀、腹痛、腹泻、便血以及炎症等，严重影响UC患者的身体健康[1]。目前，对UC病因的探究尚不完全清楚，其与机体生理、遗传因素、环境和心理变化等均关系密切[2]。目前，临床上常用于治疗UC的药物主要包括柳氮磺吡啶、氨基水杨酸、糖皮质类激素和免疫抑制剂等，虽然其短期对UC患者的症状改善有益，但如长期应用或大剂量应用则可引起多种不良反应的发生[3]。近些年来，越来越多的中药有效成分对UC的治疗展现出良好的效果[4]，其对抗UC新药的挖掘具有较好的启发作用。针对目前开发抗UC新药的需要仍迫在眉睫，从中药寻找抗UC新药是一种可行的新方法。

白芷是伞形科植物杭白芷或白芷的干燥根，具有祛风止痛、解表散寒、消肿排脓、燥湿止带以及宣通鼻窍的功效[5]。白芷乙素是白芷植物中一种呋喃香豆素类活性成分，其抗炎、抗氧化、保护心血管和抗凋亡等新的药理作用已逐渐被发现[6]。已有研究报道白芷可通过降低IL-1β水平，升高IL-10水平，以及下调NF-κB蛋白活性，从而改善UC大鼠的症状[7]。此外，临床研究报道茵陈白芷汤治疗慢性结肠炎湿热内蕴型39例取得较好的效果[8]。但是白芷乙素对UC是否有防治作用目前未见研究报道。基于前期本课题组预实验初步筛查发现白芷乙素对UC小鼠具有明显的症状改善作用，本实验通过构建急性UC小鼠模型，探讨白芷乙素对小鼠UC的作用及其机制，以期为日后抗UC新药开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

白芷乙素（质量分数≥98%，上海晨易生物科技有限公司，批号：20190205）；TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 ELISA检测试剂盒（博士德生物技术有限公司，批号分别为23913119104、42574412547、32565248754、65487547821）；SOD和MDA检测试剂盒（南京建成生物有限公司，批号分别为20210412、20210324）；TLR4和NF-κBp65单克隆抗体（abcam公司，批号分别为HM2298、CH4257）。

1.2 动物分组与给药

2月龄雄性SPF级C57BL/6小鼠60只，体质量18~22 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXX（湘）2018-0003。动物适应性喂养7 d后开始本实验。将小鼠按体质量随机分为空白对照组、模型组、柳氮磺胺吡啶组（LD组：0.5 g/kg）、白芷乙素低剂量组（BZ-L：6 mg/kg）、白芷乙素中剂量组（BZ-M：12 mg/kg）和白芷乙素高剂量组（BZ-H：24 mg/kg），每组10只。建模当天灌胃给药，连续7 d，空白对照组和模型组灌胃等量生理盐水。

1.3 溃疡性结肠炎模型构建

参照文献[9]方法构建小鼠UC模型，具体方法如下：小鼠连续自由饮用3%DSS水溶液7 d，其中每隔1天更换新配的DSS溶液。空白对照组饮用正常水。

1.4 疾病活动指数（DAI）评分

实验过程中每日观察各组小鼠的行为学，观察大便的性状、便血等，主要参照文献[10]方法对各组小鼠进行DAI评分，详见表1。

表1 DAI评分标准Table 1 Scoring criteria of DAI

1.5 结肠组织形态损伤评分

本实验第7天结束后，采用颈椎脱臼方式处死小鼠，剖开动物腹腔，小心取出小鼠结肠部，并纵向剪开结肠，观察结肠组织大体的形态学变化，并按表2的评分标准对动物进行评分[11]。

表2 结肠组织形态损伤评分标准Table 2 Scoring criteria of morphological injury of colon tissue

1.6 结肠组织病理学观察

实验结束后，小心切取各组小鼠统一部位的结肠组织，10%（φ）中性甲醛浸泡72 h后，按以下步骤进行石蜡包埋切片以及HE染色，石蜡包埋步骤：流水冲洗结肠组织过夜，70%（φ）酒精浸泡24 h，80%酒精浸泡24 h，95%酒精浸泡6 h，100%酒精浸泡3 h，二甲苯浸泡5 min，石蜡浸泡3 h后，进行石蜡包埋及切片（厚度为5 μm）。HE染色步骤：二甲苯浸泡2次，5 min/次，100%酒精浸泡5 min，95%酒精浸泡5 min，70%酒精浸泡5 min，蒸馏水浸泡5 min，苏木素染液浸泡5 min，伊红染液浸泡15 s，晾干后，封片，镜检。

1.7 结肠组织炎症因子指标检测

按质量（结肠组织）∶体积（生理盐水）比=1∶9制备结肠组织匀浆，准确称取结肠组织，加入9倍体积生理盐水，使用玻璃匀浆器于4℃冰上研磨，4℃，4 000 r/min离心15 min，分离上清，置于−80℃冰箱保存备用。采用ELISA试剂盒检测结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的水平。

1.8 结肠组织氧化应激指标检测

结肠组织匀浆制备同“1.7”，按检测试剂盒说明书步骤检测结肠组织SOD活性以及MDA水平。

1.9 结肠组织TLR4和NF-κB p65蛋白表达水平检测

结肠组织匀浆制备同“1.7”，随后100℃水浴加热变性蛋白，测定蛋白浓度。每孔上样40 μg蛋白，常规电泳分离和转PVDF膜，5%BSA封闭液封闭2 h，分别使用的TLR4（1∶2 000）、NF-κB p65（1∶2 000）、β-actin抗体（1∶2 000）4℃孵育过夜和山羊抗兔IgG抗体（1∶3 000）室温孵育2 h，PBST清洗5次，5 min/次，滴加200 μL显影剂后，使用凝胶成像系统成像。

1.10 统计学方法

使用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析。多组间均数比较采用单因素方差分析和LSD检验，计量资料用表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况观察

实验前各组小鼠均无异常表现。模型组小鼠造模后第2天粪便开始出现异常，并逐渐变软和稀，第5天出现肉眼可见的血便现象和肛门出血。经给药治疗后，小鼠以上症状有比较明显的改善，其中BZ-H组和LD组改善作用最优。

2.2 各组小鼠DAI评分

与空白对照组比较，模型组的DAI评分明显升高（P<0.01）。与模型组比较，各给药组的DAI评分明显降低（P<0.05），其中BZ-H组和LD组DAI评分改善效果最优，见表3。

表3 各组小鼠DAI评分结果Table 3 DAI score of mice in each group(xˉ±s,n=10)

2.3 各组小鼠结肠组织形态损伤评分

与空白对照组比较，模型组的结肠组织形态损伤评分明显升高（P<0.01）。与模型组比较，各给药组的结肠组织形态损伤评分则明显降低（P<0.05），其中BZ-H组和LD组结肠组织形态损伤评分改善效果最好，详见表4。

表4 各组小鼠结肠组织形态损伤评分结果Table 4 Morphological injury score of colon tissue of mice in each group(±s,n=10)

表4 各组小鼠结肠组织形态损伤评分结果Table 4 Morphological injury score of colon tissue of mice in each group(±s,n=10)

与空白对照组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01。

组别空白对照组模型组LD组BZ-L组BZ-M组BZ-H组分数0.00±0.00 4.36±0.68**2.65±0.57##3.76±0.78#3.23±0.45#2.55±0.76##

2.4 各组小鼠结肠组织病理学观察

空白对照组小鼠结肠黏膜上皮排列整齐，结肠绒毛完整，结肠肠腺多种细胞排列整齐，未炎症细胞浸润。模型组小鼠肠绒毛破损严重，有脱落坏死，大部分肠腺出现坏死和溶解，可见大量炎性细胞浸润。给予药物后，以上损伤出现不同程度的改善，结肠黏膜结构分层比较清晰，结肠肠腺细胞排列比较整齐，炎性细胞数量明显减少，其中BZ-H组和LD组结肠组织病理变化改善最优，见图1。

图1 各组小鼠结肠组织病理学变化（HE染色，200×）Figure 1 Histopathological changes of colon tissue of mice in each group(HE staining,200×)

2.5 各组小鼠结肠组织炎症因子水平比较

与空白对照组比较，模型组小鼠结肠组织中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显升高（P<0.01），而抑炎因子IL-10的水平明显降低（P<0.01）。与模型组比较，各给药组的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显降低（P<0.05），而抑炎因子IL-10水平则明显升高（P<0.05），其中BZ-H组和LD组改善效果最优，见图2。

图2 各组小鼠结肠组织炎症因子水平Figure 2 Levels of inflammatory factors in colonic tissue of mice in each group(xˉ±s,n=10)

2.6 各组小鼠结肠组织SOD活性和MDA水平

与空白对照组比较，模型组结肠组织SOD活性明显降低（P<0.01），而MDA水平明显升高（P<0.01）。与模型组比较，各给药组的SOD活性明显升高（P<0.01），而MDA水平明显降低（P<0.05），其中BZ-H组和LD组改善效果最好，见图3。

图3 各组小鼠结肠组织SOD活性和MDA水平Figure 3 SOD activity and MDA level in colon tissue of mice in each group(xˉ±s,n=10)

2.7 结肠组织TLR4和NF-κBp65蛋白表达水平

与空白对照组比较，模型组结肠组织的TLR4和NF-κB p65的蛋白表达量明显升高（P<0.01）。与模型组比较，各给药组结肠组织的TLR4和NF-κB p65的蛋白表达量明显降低（P<0.05），其中BZ-H组和LD组改善效果最好，见图4。

图4 各组结肠组织TLR4和NF-κB p65蛋白表达水平Figure 4 Expression TLR4 and NF-κB p65 in colon tissues of mice in each group(xˉ±s,n=10)

3 讨论

UC是一种慢性非特异性炎症性的肠道疾病，UC患者经常出现腹痛、黏液便和排脓血便等症状，目前，其发病机制尚不得知，可能是由于外部环境引起宿主的免疫反应和基因改变等[12]。柳氮磺吡啶在临床上常用于治疗UC的常用药物，但长期使用多种严重副作用，如中性粒细胞缺乏、药疹和剥脱性皮炎等[13]，故抗UC新药的开发仍是目前极为重要的任务之一。

本实验通过自由饮用3%DSS溶液构建小鼠UC模型，观察白芷乙素抗UC的作用效果。本研究发现，白芷乙素各剂量组均能明显改善UC小鼠症状，如降低DAI评分，减轻结肠组织损伤以及减少结肠组织炎症细胞的浸润，其中BZ-H组的改善效果最优。在炎症发展过程中，TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10作为重要的细胞因子参与到多种的炎症信号通路中。其中TNF-α和IL-1β常用于评价机体炎症严重程度的重要指标[14]。IL-1β参与了UC患者的免疫应答反应，而TNF-α参与了UC患者结肠黏膜损伤[15]，两者与UC的发生发展密切相关。IL-10是一种重要的炎症抑制因子，其可通过抑制机体多种炎症因子的合成，如TNF-α、IL-1β、IL-6等[16]，调节机体的炎症反应。此外，IL-10还可调节机体肠道细胞的免疫平衡，维持正常肠道黏膜微生态平衡[17]。SOD活性和MDA水平是反映机体氧化损伤严重程度的重要指标[18]。本研究发现白芷乙素能够显著降低UC小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平，升高结肠组织IL-10水平和SOD活性，改善UC小鼠的炎症和氧化损伤。

NF-κB是UC炎症过程得以持续发展的重要指标，其通过促进多种致病因子表达和释放[19]，如TNF-α、IL-1β、IL-6引起机体产生级联效应的炎症反应，使炎症过程持续放大，进一步导致肠黏膜损伤，引导UC的发生发展[20]。本研究发现，白芷乙素各剂量组可明显降低UC小鼠结肠组织中TLR4和NF-κB p65蛋白表达水平，提示白芷乙素可抑制UC小鼠TLR4/NF-κB p65信号通路，这可能是其抗UC的重要作用机制。

综上所述，白芷乙素对DSS诱导的UC小鼠具有一定的保护作用，其机制可能与抑制炎症、抗氧化损伤以及调节TLR/NF-κB信号通路有关。本研究为抗UC新药研发提供了实验依据。