4种结核分枝杆菌潜伏感染检测方法的比较

钟明浩，黄裕春，关海舰，谢文聪，梁汉成，麦伟珍，叶小华，钟新光

（1.东莞市第六人民医院，广东东莞 523000；2.东莞市中心血站，广东东莞 523000；3.广东药科大学公共卫生学院，广东广州 510310）

结核病是一种严重危害人群健康的呼吸道传染病，在人群中流行和传播可能产生新的结核病患者，同时也可能会产生新的结核杆菌潜伏感染者，潜伏感染者可在一定条件下发病成为结核病患者。据估计，全世界有四分之一至三分之一的人口可能感染结核分枝杆菌[1]，因此对潜伏感染群体的筛查有重要意义。最新数据表明[2]，广东省流动人口达到五千万。据报道[3]，在肺结核整体发病率下降的同时，流动人口的发病率出现了上升趋势。流动人口活动范围大，接触人群广，是肺结核的高危人群。传统结核杆菌潜伏感染的检测依赖结核菌素皮肤试验，该方法实际应用具有一定的局限性，而国外的γ-干扰素释放试验相关试剂价格昂贵，限制了在人群中的大规模应用。近年来，国内研发多种结核潜伏感染检测试剂，如蛋白芯片以及γ-干扰素检测试剂，但这些试剂缺乏在不同人群中的大规模评估。本研究选取华大IgG抗体检测试剂盒、普瑞康IgG抗体检测试剂盒、希格T细胞检测试剂盒、迪澳T细胞检测试剂盒共4种国产试剂，分别与世界卫生组织推荐的QuantiFERON-TB（QFT）试验检测试剂进行比较分析。

1 对象与方法

1.1 一般资料

研究对象为未被诊断为活动性肺结核的人群，选取符合纳入标准的研究对象共1 200人，研究对象均知情同意。其中男性738人，女性462人；年龄中位数35岁，四分位距12岁，最小年龄18岁，最大年龄62岁；20岁以下35人，20~40岁766人，40岁及以上399人。进行结核分枝杆菌IgG抗体检测的适用样本为血清，标本采集时不加抗凝剂，自然凝血，要求标本清亮、无溶血。进行γ-干扰素释放试验检测的标本为肝素抗凝血标本，不得使用EDTA抗凝，室温15~25℃运输和保存，不得冷藏或冷冻。

1.2 主要仪器和试剂

TS-1000恒温振荡器（常州金坛精达仪器制造有限公司）、AE-1000生物芯片阅读仪（北京华大吉比爱生物技术有限公司）；结核分枝杆菌IgG抗体谱检测试剂盒（微阵列酶联免疫法，北京华大吉比爱生物技术有限公司）；结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒（化学发光蛋白芯片法，深圳市普瑞康生物技术有限公司）；结核感染T细胞释放γ-干扰素检测试剂盒（酶联免疫斑点法，广东希格生物科技有限公司）；SPOTest检测试剂盒（广州迪澳生物科技有限公司）。

1.3 方法

对采集的样本分别使用4种方法进行检测，与QFT检测结果进行比较分析。

1.3.1 华大IgG抗体谱检测试剂盒4种重组抗原16 kDa、38 kDa、Ag85B和MPT64以特定微阵列的形式排布在微孔板内，板孔中加入待测血清样本温育反应、洗涤最后加入发光液。若样本中含有一种或多种针对上述几种抗原的抗体，其特异性相对应的抗原点会产生发光信号。阳性对照发光信号值应>500，阴性对照发光信号值应<150。

1.3.2 普瑞康IgG抗体检测试剂盒 基于化学发光蛋白芯片技术检测血清中的TB-IgG。将16 kD、38 kD和LAM等5种抗原固定在醛基化玻片片基上制备成蛋白芯片，用来捕捉被测血清样本中上述结核抗原的IgG抗体，利用抗人IgG的酶标抗体来测定样本中的TB-IgG。

1.3.3 希格γ-干扰素检测试剂盒 经适当分离、处理的外周血单个核细胞（PBMCs）与结核分枝杆菌特异性抗原一起加入到预包被抗γ-干扰素抗体的PVDF膜微孔中，培养一段时间。分泌出的γ-干扰素会被PVDF薄膜上特异抗体捕获，通过显色底物使其在反应部位形成不溶性斑点。每一个斑点代表1个γ-干扰素分泌结核特异效应T细胞。记数斑点数量可以获得外周血中结核特异的效应T细胞数量。

1.3.4 迪澳SPOTest检测试剂盒 在检测时，将人外周血T淋巴细胞与致病性结核外周血结核杆菌刺激物在预包被了抗人IFN-γ的细胞培养板上共培养，经过酶联免疫显色，通过目测或使用放大镜等计数斑点。每个斑点代表一个分泌细胞因子的效应T细胞，计数斑点数量可以获得外周血中结核特异性T细胞的数量，进而判断机体是否存在结核分枝杆菌特异性的免疫反应。

1.4 统计学分析

所有数据均采用SPSS23.0软件进行统计学分析，一般资料以中位数和四分位距表示，不同检测方法间进行一致性检验，率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。采用诊断试验评价4种国产试剂的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比、约登指数。

2 结果

2.1 检测试剂盒检测阳性率

选取1 200例研究对象标本检测，其中华大IgG抗体检测试剂盒、普瑞康IgG抗体检测试剂盒、希格T细胞检测试剂盒检测结果阳性率分别为0.92%、13.5%、12.42%，均低于QFT检测法（P<0.01）。迪澳T细胞检测试剂盒阳性率32.42%，高于QFT检测法（P<0.01），见表1。

表1 4种国产检测试剂盒与QFT检测结果比较Table 1 Comparison of four domestic test kits and QFT test results

2.2 一致性检验

结果显示，华大IgG抗体检测试剂盒与QFT的Kappa值为0.034，差异有统计学意义（P<0.01），提示两种方法检测结果具有一致性。普瑞康IgG抗体检测试剂盒与QFT的Kappa值为0.013，差异无统计学意义（P>0.05），提示两种方法检测结果不一致。希格T细胞检测试剂盒与QFT的Kappa值为0.511，且具有统计学意义（P<0.01），提示2种方法检测结果具有一致性。迪澳T细胞检测试剂盒与QFT的Kappa值为0.699（一致性最高），且具有统计学意义（P<0.01），提示2种方法检测结果具有一致性，见表2。

表2 4种检测方法的一致性检验Table 2 Consistency test of four testing methods

2.3 灵敏度和特异度检验

以QFT检测方法为标准，对4种国产检测方法进行灵敏度和特异度的检验，结果显示，华大IgG抗体试剂盒灵敏度和特异度分别为2.67%、99.67%，普瑞康IgG抗体试剂盒灵敏度和特异度分别为14.33%、86.78%，希格T细胞检测试剂盒灵敏度和特异度分别为44.33%、98.22%，迪澳T细胞检测试剂盒灵敏度和特异度分别为90.00%、86.78%，其他评价指标见表3。

表3 4种检测方法的诊断试验分析结果Table 3 Analysis of the diagnostic value of four detection methods

3 讨论

结核病是由结核分枝杆菌感染导致的慢性传染性疾病，2020年全球结核报告显示[4]，2019年全球新发结核病患者约996万，死亡约121万。全球结核潜伏感染人群接近20亿，大约5%~10%会发展为结核病患者。结核潜伏感染（LTBI）病例被定义为对结核分枝杆菌持续免疫反应的状态，没有临床上证明的活动性结核病证据。美国境内发生的结核病传播也表明[5]，超过85%的结核病病例来自潜在结核病感染的重新激活。识别结核潜伏感染者是结核病控制的一个重要组成部分[6]。因此，为了实现2035年终止结核，就必须解决结核潜伏感染问题。

由于没有诊断LTBI的黄金标准测试，因此评估LTBI的真实流行率和诊断测试的准确性具有挑战性。准确识别和治疗LTBI对于结核病的控制和消除至关重要。缺乏诊断LTBI的黄金标准意味着该疾病的真正流行率未知，并且对诊断测试的敏感性和特异性的估计带来偏差[7]。在一项对QFT和TST（tuberculin skin test，结核菌素皮肤试验）检验效能的测试中，发现QFT比TST有更高的特异性，甚至在免疫功能低下的受试者中，都有着高度可比的结果。与TST相比，QFT阳性与结核病感染风险一致[8]，而且在QFT值为负的受试者中结核病发展的风险也非常低[9]。但QFT检测成本高，且实验室密集型QFT测试仍然有限或不可用[10-11]。因此，为探索能大规模应用于日常检测的测试方法，本次研究选取了4种检测试剂盒，通过与QFT进行比较分析，得到成本低、特异性高、诊断阳性率高的检测技术。

华大IgG抗体检测试剂盒（微阵列酶联免疫法）是集成酶联免疫吸附试验（ELISA）技术和微阵列（Array）技术形成的新一代检测技术体系。在保持了ELISA方法学的成熟、方便、敏感性及特异性都较为良好的基础上，又具有微阵列技术的高通量、低成本、高平行、微型化等特点[12]。本次研究结果显示，与国际推荐的QFT检测结果25.00%相比，华大IgG抗体检测试剂盒检验阳性率只有0.92%，差异有统计学意义（P<0.01），这与另外一项研究[10]的阳性率结果相近（1.25%）。

普瑞康IgG抗体蛋白芯片是一种能够简便快速诊断肺结核的方法，通过测定人血清中特异性的结核分枝杆菌抗体来诊断肺结核，通过多种抗原对应抗体互补，弥补了其他方法检测漏检的不足。一项研究发现[13]，在组合蛋白抗原与血清的作用中，阳性率（12.7%）高于单独抗原蛋白的阳性率（7.6%）。本研究结果表明，普瑞康IgG抗体检测试剂盒阳性率13.50%，与国际推荐的QFT检测结果25.00%相比，差异具有统计学意义（P<0.01）。阳性率较低可能与此检测方法本身性质有关，对于所选人群中免疫低下的研究对象，可能降低了其阳性率。

希格T细胞检测试剂盒所用方法属酶联免疫斑点法，与传统的结核菌素皮试试验相比，该方法不受卡介苗（BCG）接种的影响，特异性检测结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）引起的结核感染。另外，检测结果一次就能获得，患者无须返回观察，实验室质量控制更为容易。有研究标明[14]，在健康人群中，酶联免疫斑点干扰素释放试验的阳性率为16.7%。本研究结果显示，希格T细胞检测试剂盒阳性率12.42%，低于国际推荐的QFT检测结果25.00%，差异具有统计学意义（P<0.01）。由于受试者身体状况的原因（如HIV感染、糖尿病、使用免疫抑制剂治疗等）造成免疫功能下降甚至丧失，可能出现假阴性结果。

迪澳T细胞检测试剂盒所用方法属酶联免疫斑点法，于体外定性检测外周静脉抗凝血中结核分枝杆菌特异性的T细胞免疫反应。酶联免疫斑点法在淋巴结核和肺结核等检测中，均具有较高的阳性率，能更敏感的检测出早期或者既往感染的患者，是作为诊断肺结核的重要辅助依据[15]。有报道表明[16]，酶联免疫斑点检测法在潜伏组的检测中，阳性率为31.0%，本研究结果显示，希格T细胞检测试剂盒阳性率32.42%，高于国际推荐的QFT检测结果25.00%，差异具有统计学意义（P<0.01）。

通过分析4组检测方法的一致性，均以世界卫生组织推荐的QFT检测结果为评价标准，其中迪澳T细胞检测试剂盒检测方法Kappa值>0.6，一致性较好，希格T细胞检测试剂盒检测方法Kappa值<0.4，一致性中等，其他Kappa值均>0.4，一致性较差。通过对4种检测方法的灵敏度和特异度检验，迪澳T细胞检测试剂盒具有最高的灵敏度和特异度，能更准确地检测到阳性对象，减少漏诊的情况，但本次研究对象的阳性预测值略低，可能受到人群差异和实验室操作等因素的影响，应加大筛查人群，进一步探究其检验效能。本次研究迪澳T细胞检测试剂盒阳性率检出在4种检测方法中最高，与其他相关研究结果[17]相近。

目前对于LTBI，仍缺乏大规模筛查检测技术，虽然世界卫生组织推荐QFT，但仍存在许多不足之处，比如，价格昂贵[18]，不同人群检验效能的差异。有研究表明[19]，对于接种了卡介苗的个体来说，QFT具有更高的特异性和灵敏性。但在未接种卡介苗人群中诊断LBTI的QFT效能可能不如TST。此外本次选取的4种检测方法，结果仍受到多方面的因素影响，包括免疫功能低下可能为阴性，只能用于血清样本的检测而不能用于检测其他体液样本等，这些都会制约大规模开展筛查来发现LTBI。因此，应综合考虑实际情况，选择具有更好预测价值的筛选方法或开展更大规模的科学实验进行验证。