基于SSR分子标记的13个白三叶(Trifolium repens L.)品种指纹图谱构建

马骢毓， 韩重阳， 马赛男， 李旭旭， 蔡家邦， 汪 阳， 张新全， 聂 刚

(四川农业大学草业科技学院， 四川 成都 611130)

白三叶(TrifoliumrepensL.)是一种优质的多年生豆科植物，在全世界温带地区广泛分布，因其具有较高的营养价值且适应范围广，再生能力强，不仅被用作优质牧草[1]，还可广泛应用于水土保持和城市绿化，具有良好的生态价值和经济价值[2]，在我国西南地区被广泛栽培利用。目前，生产上大量应用的品种主要为1988年审定的‘胡依阿’白三叶及2002年审定的‘海法’白三叶[3-5]。全国审定白三叶品种仅6个，远不能满足生产需求，因此，生产上引入大量适应性强、表现突出的国外白三叶品种用于栽培饲草、草地建植和植被恢复等。

随着现代分子技术的快速发展，DNA分子标记技术已经成为植物新品种鉴定的重要手段[6]。简单重复序列(Simple sequence repeats，SSR)分子标记技术是一类建立在PCR反应基础上的一种遗传标记，具有操作简便、多态性高、准确性高等优点[7]。基于SSR分子标记技术的DNA指纹图谱可有效的鉴定白三叶品种，为品种知识产权保护提供科学依据。虽然SSR分子标记技术已广泛应用于多花黑麦草(LoliummultiflorumL.)[8]、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)[9]、鸭茅(DactylisglomerataL.)[10]、早熟禾(PoaannuaL.)[11]等草类植物的品种DNA指纹图谱的构建及鉴定中，但针对白三叶品种鉴定及DNA指纹图谱构建方面研究鲜有报道。目前，白三叶SSR分子标记技术研究多集中在遗传多样性分析方面，张鹤山等[12]利用SSR分析从国内外收集的49份白三叶种质资源的遗传多样性，认为白三叶种质间差异较大，具有丰富的遗传多样性。李莉等[13]利用SSR标记对贵州野生22份白三叶种质资源进行了系统分析，揭示了贵州地方品种间的亲缘关系。

本研究利用SSR分子标记技术分析国外不同来源的13个白三叶品种间的遗传多样性，同时构建DNA指纹图谱，为白三叶育种材料的选择及品种的快速鉴定提供了理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验白三叶品种的收集

本研究使用的13个白三叶(TrifoliumrepensL.)品种见表1，采集的13个白三叶参试品种均种植于四川农业大学崇州基地(30°32′N，103°39′E，海拔508 m)。

表1 13份不同白三叶品种来源信息

1.2 DNA提取

随机取样于四川农业大学现代农业研发基地。从30株单株中随机采集30片新鲜幼叶，每10片鲜叶混合构建一个独立的混样池(Bulk)，每个品种3个混样池(Bulk)作为3次重复[14-15]。采用安全型植物DNA小提试剂盒(广州美基生物科技有限公司，Magen®,Guangzhou,China)直接提取白三叶基因组DNA。测定DNA浓度和质量后，将DNA稀释至20 ng·μL-1，并置于4℃保存。

1.3 引物设计及PCR扩增

试验引物筛选自Griffiths等[16]报道的白三叶遗传连锁图谱，通过对染色体不同片段位置上的引物进行均匀选择，将所选的264对SSR引物进行初筛，基于“多态性高、特异性强、条带清晰稳定”的原则，共筛选出20对引物(表2)来扩增白三叶SSR片段。PCR扩增的总体积为20 μL，其中含有2 μL(20 ng·μL-1)的参试品种DNA，10.5 μL的2×Taq PCR MasterMix II(天根®，北京，中国)，1.4 μl(10 pmol·μL-1)正向和反向引物混合物，以及6.1 μL ddH2O。PCR扩增使用热循环参数，程序如下:94℃预变性5 min；然后94℃变性1 min，55℃退火30 s，72℃链延伸40 s，35个循环；最后72℃链延伸5 min，4℃保存。

表2 SSR引物信息

扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶上进行检测。在0.1%的AgNO3溶液中银染15 min后在NaOH溶液中显色。将凝胶置于灯光下，用数码照相机拍照保存以供后期分析使用[17]。

1.4 数据统计与处理

对扩增产物电泳结果图中的明亮条带或清晰弱带进行统计得到基础数据。以“1”和“0”两种数字表示条带的分布情况。“1”代表有条带的位置，“0”代表无条带的位置，建立原始标准0/1矩阵。计算多态性条带比率(Percentage of polymorphic bands，PPB)和引物多态性信息含量(Polymorphism information content，PIC)，PICi=2fi×(1—fi)(fi表示第i个基因的频率)。利用GenAIEx 6.4分析计算品种内部和品种之间的变异分布，使用NTSYS-PC 2.10e和MEGA 6软件进行聚类分析和主成分分析。根据扩增结果，利用Chemilmager 4400软件估算每个扩增片段的分子量大小。根据所选SSR引物制作DNA指纹图谱，对扩增样品中出现至少两次的条带进行计数，即每个品种出现至少2次相同分子量的条带，然后利用Excel 2010软件对波段统计数据进行转换，构建13个白三叶草品种的DNA指纹图谱。

2 结果与分析

2.1 白三叶草品种遗传分异分析

试验引物筛选自Griffiths等[16]报道的白三叶遗传连锁图谱，通过对染色体不同片段位置上的引物进行均匀选择，将所选的264对SSR引物进行初筛，基于“多态性高、特异性强、条带清晰稳定”的原则，共筛选出20对引物。3组供试品种混合样本扩增，只分析至少出现两次的清晰可辨条带(图1)。结果表明，13个白三叶品种在20对引物中共检测出了115条清晰可见的条带，其中11个条带无多态性，104条带具有多态性(占90.4%)(表3)。此外，每对引物的多态性条带(PPB)的百分比在50%～100%之间，扩增片段的长度在100～250 bp之间。在20对引物中，gtrs167扩增条带最多，扩增总条带数达9条，引物gtrs171多态性信息含量最低，为0.198；引物gtrs949的PIC最高为0.455。本试验所使用的20对引物中平均每对引物扩增出5.75个条带，多态性条带5.2条。所有引物的PIC范围为0.198～0.455，每个SSR位点的PIC均值为0.333。

图1 引物gtrs540在13个白三叶品种的扩增

表3 SSR引物在白三叶品种上的扩增结果

AMOVA结果显示(表4)，通过SSR分子标记获得的总差异的49%存在于白三叶品种间，51%存在于白三叶品种内。品种之间有极显著差异(P<0.01)，具有统计学意义。

表4 基于SSR原始数据的白三叶品种的分子方差分析

2.2 13份白三叶品种的聚类分析

基于遗传相似性系数和遗传距离矩阵，使用NTSYS-pc 2.10e和MEGA 6对13个白三叶品种进行聚类分析(图2)。结果表明，其品种内遗传相似性系数的平均变异范围为0.686～0.959，品种间遗传相似性系数的平均变异范围0.556～0.739。13个白三叶品种间，‘超级海法’和‘海法’的遗传相似性系数(GS)最大，说明它们的亲缘关系最近。‘米莉格’和‘克朗德’的遗传相似性系数(GS)最小，即遗传距离最远，亲缘关系也较远。白三叶品种‘超级海法’的一枝中混合了‘海法’的一个样品，可能由于‘超级海法’在选育过程中是基于‘海法’白三叶为亲本选育，故具有较近的亲缘关系。‘艾丽丝’和‘超级胡依阿’各仅有一小枝也被划分到同一枝上，其余品种都可以较好的聚在一起。

图2 SSR标记对13份白三叶品种的聚类分析

2.3 13份白三叶品种的主成分分析

为更直观的了解13个白三叶品种之间的亲缘关系，采用主成分分析(Principal component analysis,PCA)进行进一步的评价(图3)。其中第一主成分的贡献率为17.4%，白三叶品种‘克朗德’分布于PC1坐标轴的左侧，‘西维特’和‘米莉格’分布于PC1坐标轴的右侧。第二主成分的贡献率为13.8%，‘克朗德’、‘胡依阿’和‘西维特’被划分在PC2坐标轴的上方，‘米莉格’被划分在PC2坐标轴的下方。其余9个白三叶品种主要分布于坐标轴原点附近。主成分分析结果与遗传聚类图的表现基本一致。

图3 13个白三叶品种的主成分分析

2.4 13个白三叶品种指纹图谱的构建

以筛选出的多态性引物扩增出的电泳图为基础，选择6对具有代表性的引物gtrs1164，gtrs573，gtrs541，gtrs171，gtrs536和gtrs173构建DNA指纹图谱。如图4所示，gtrs573的178 bp，gtrs171的190 bp，gtrs541的205 bp，gtrs541的170 bp和gtrs536的265 bp可以直接将‘克朗德’、‘游侠’、‘超级胡依阿’、‘麦克’和‘欧米克’分别区别出来。在gtrs171的170 bp处仅有‘欧米克’和‘米莉格’出现了多态性条带，而‘米莉格’在gtrs573的237 bp处没有多态性条带，因此可以将这两个白三叶品种区分开来。通过此种方法还可以在gtrs536的153 bp和gtrs171的135 bp将‘胡依阿’区分出来。在gtrs573的155 bp仅有‘艾丽丝’和‘罗特’没有多态性条带，而gtrs536的214 bp处‘罗特’出现了多态性条带，因此这两对引物还可以将‘艾丽丝’和‘罗特’区别开来。同理，在gtrs536的214 bp和gtrs541的182 bp，gtrs573的178 bp和gtrs541的163 bp，gtrs1164的210 bp和180 bp，gtrs173的170 bp和gtrs541的255 bp可以将‘超级海法’、‘金宝’、‘海法’、‘西维特’分别鉴别出来。结果表明，6种引物可以区别13份白三叶品种，通过这6对引物所构建的DNA指纹图谱具有较强的鉴定、区别这13个白三叶品种的能力。因此，本试验所选择的引物具有较强的品种鉴别能力。

图4 基于部分多态性引物扩增的13份白三叶品种的DNA指纹图谱

3 讨论

遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，可为植物育种提供重要信息，能够反映物种的遗传背景以及利用价值，甚至能够保护和发掘优良种质[18]。SSR分子标记能够反映被标记生物的DNA，已被广泛应用在品种[19]及纯度鉴定[20]和遗传多样性分析[21]。本试验利用SSR研究13个引进白三叶品种种质资源的多样性，结果表明，SSR分子标记在13个白三叶品种中具有较高多态性，试验所用20对SSR引物共检测到13个品种的104条多态性条带，多态性比率(PPB)达90.4%，高于李莉等[22]利用SSR标记分析花序一致的贵州野生白三叶品种研究中的PPB(85.99%)，且黄婷等[23]利用SSR标记进行多花黑麦草的品种鉴定研究中的PPB(88.81%)也低于本研究。试验引物筛选自Griffiths等[16]报道的白三叶遗传连锁图谱，通过对染色体不同片段位置上的引物进行均匀选择，将所选的264对SSR引物进行初筛，基于“多态性高、特异性强、条带清晰稳定”的原则，共筛选出20对引物。

本试验研究的对象白三叶是一种典型的依靠蜜蜂等虫媒传粉的异花授粉植物，易产生远距离间基因的交流。因此，要进行种质资源收集时，应先制定有效的取样策略[24]。为了准确地评价遗传多样性和进行品种鉴定，选择最佳的样本量是实现品种扩容的必要条件。在群体内取样单株数量方面，Sjogren和Wyoni[25]提出了一个针对有限群体的假设模型，认为若要检测到频率为5%的稀有等位基因，群体内的样本量至少要达到30个单株。陈坚等[26]利用SSR分子标记技术对异花授粉植物紫云英进行分析时，阐述群体内的样品取样量以30单株为宜，即可达到较佳鉴别效果又降低分析成本。针对品种内部的取样重复数量，KÖlliker等[15]将所取的白三叶单株进行分块，每个样本被划分成3个独立的混样池(Bulk)，此种方法可有效的利用AFLP技术对白三叶遗传多样性进行分析。同样，Ma等[27]也使用了此种分块方法利用SSR分子标记技术对10份白三叶品种进行品种鉴定。鉴于以上研究，本试验采用每个品种30个单株构建了3个独立的混样池(Bulk)对13个白三叶品种进行鉴定，研究结果表明，此种取样策略可以有效区分白三叶草品种。这与前人的研究结果一致。

在自然异花授粉植物居群中，品种间的变异幅度小于品种内部的变异[23]。白三叶作为异花授粉植物，具有较大的群体内差异，且各育种材料间的频繁交流使得品种间存在较小的变异程度[28]。然而，本试验中，品种内与品种间的变异幅度差异不大，主要原因可能是这13个白三叶品种绝大部分为国外育成新品种，且来源地广、地理区隔比较大，使得品种纯度较高，品种间差异增大，内部差异减小。从分子水平上说，遗传相似系数越小，变幅越大，则表明该物种的遗传分化越大，遗传多样性越高，遗传背景也就越复杂[29]。本研究13个白三叶品种间的遗传相似系数(GS)分布在0.556～0.739，最大的遗传相似系数出现在白三叶品种‘海法’和‘超级海法’之间。这可能是由于‘超级海法’在选育过程中是基于‘海法’白三叶为亲本选育，故两者具有较近的亲缘关系。而最小的遗传相似系数出现在‘米莉格’和‘克朗德’之间，表明尽管两个品种均来自丹麦地区，但可能由于引种过程中环境差异的影响导致了两个品种之间遗传距离较大，出现因环境变化产生的基因突变，同时也表明引进品种中存在较高的遗传多样性，具有较高的利用价值[30]。

品种或种质资源的特异性是新品种保护的技术基础和授权的科学依据[31]。利用分子标记技术构建品种指纹图谱，可以快速准确的进行品种(系)的鉴定，同时具有很强的个体特异性，为作物育种和种子管理工作提供了极大的便利[32]。SSR分子标记技术作为比较理想的分子标记技术之一[33]，已被广泛应用于高羊茅(FestucaarundinaceaS.)[34]、多花黑麦草[35]、红三叶(TrifoliumpratenseL.)[36]等多个物种的品种鉴定。本研究先筛选出具有较高多态性的均匀分布在白三叶染色体上的SSR引物，再经过人工筛选20对多态性较好的SSR引物构建DNA指纹图谱，对13份白三叶品种进行遗传多样性分析。根据已构建DNA指纹图谱分析，13份白三叶品种均可通过SSR引物进行品种鉴定。遗传多样性分析及DNA指纹图谱的构建对白三叶种质创新、品种选育及鉴定均具有积极的作用，也可为新品种知识产权保护与有效利用提供保障。就本研究而言，随着白三叶国外品种的不断引进且筛选的引物数量有限，特征条带也可能在其它品种中出现，因此目前的引物组合在一定的材料范围内适用。

4 结论

本研究利用SSR分子标记技术对国外引进13个白三叶品种进行聚类分析并筛选利用6种具有代表性的引物构建DNA指纹图谱。本研究探讨了13份白三叶品种之间的亲缘关系，同时也使用所构建的DNA指纹谱图将白三叶品种清晰、有效的鉴别出来。研究表明，DNA指纹图谱的构建对鉴定和区分白三叶新品种具有重要意义。