共聚焦显微镜在感染性角膜炎中的应用研究进展*

2021-10-20 00:30蓝倩倩综述曾思明审校
现代医药卫生 2021年19期
关键词:阿米巴角膜炎显微镜

蓝倩倩 综述,曾思明 审校

(广西壮族自治区人民医院眼科,广西 南宁 530021)

在发展中国家,感染性角膜炎的发生率仅次于白内障的致盲性眼病[1-2],其病原学的鉴别一直是诊断的难点。传统的检查方法具有局限性,共聚焦显微镜能够从细胞水平上对活体组织进行无创伤检查,其在感染性角膜炎的诊断鉴别和治疗指导上起到了功不可没的作用。眼科工作者需要熟悉并掌握共聚焦显微镜在不同病原体感染性角膜炎中观察到的特征,才能更好地应用其指导临床工作。本文对共聚焦显微镜在感染性角膜炎中的应用进行了综述,以期为临床医生提供参考。

1 感染性角膜炎现状

感染性角膜炎是由多种因素引起角膜上皮细胞损伤之后病原体入侵从而导致炎性反应的病理过程。细菌、真菌、病毒是最常引起角膜感染的病原微生物,棘阿米巴引起感染性角膜炎的报道逐年增加,衣原体、结核杆菌等也可引起感染性角膜炎。角膜创伤、佩戴角膜接触镜被认为是感染性角膜炎的常见诱发因素。随着我国步入老龄化社会,感染性角膜炎的发生率逐年增加,这与临床上不合理使用免疫制剂、糖皮质激素及广谱抗生素等因素密切相关。感染性角膜炎患者病情易反复发作、疾病迁延不愈,常与其他疾病混淆,因此误诊率高且治疗困难大,如不及时治疗可造成角膜穿孔、眼内炎、视力丧失等严重后果。感染性角膜炎的年发生率为0.36/10 000~79.90/10 000。由于多种因素的影响,不同地区甚至不同国家的感染性角膜炎流行病学的地区分布特点和发病相关危险因素存在差异。据统计,每年因角膜感染引起单眼盲的患者约有200万例[3]。2002年于中国香港开展的感染性角膜炎研究显示,感染性角膜炎发生率约为6.3/100 000,而在使用角膜接触镜的人群中,该病发生率高达3.4/10 000[4]。目前,中国内地尚未开展相关的流行病学研究。因此,应进一步研究,从而助力感染性角膜炎的临床诊疗。

2 感染性角膜炎传统检查手段

引起感染性角膜炎的病原体种类繁多,且该病临床表现复杂,易与其他疾病混淆,从而造成诊治困难。为挽救感染性角膜炎患者的视力,避免造成角膜穿孔、眼内炎等严重后果,临床医生应快速明确诊断。目前,诊断感染性角膜炎不仅要根据患者病史及临床特征进行鉴别,还需完善病原学的实验室检查。角膜刮片细胞学检查、培养法和组织活检法是常见的实验室检查方法,其中,角膜病灶刮片镜检能有效、快速粗筛病原菌。目前,诊断感染性角膜炎的“金标准”是病灶的病原学培养,但该辅助检查存在较多缺陷,如:(1)标本范围、部位会对病原学检查结果造成一定影响。若取标本部位偏、范围小,则病原体检出阳性率偏低。扩大取标本范围或进行多次取材,不仅病原体检出阳性率偏高,且会人为地损伤患者角膜,加重疾病进展。(2)不同病原体生长周期长短各异,部分病原体培养周期久,等完成培养再治疗会延误诊治。大多数真菌性角膜炎患者病原学培养周期为3 d,部分真菌的培养周期为5~7 d,培养周期需2周以上时间的真菌约占25%。(3)病原学检出率低,不利于快速明确诊断与正确治疗。1989-1998年开展的一项感染性角膜炎研究纳入了2 220名细菌性角膜炎患者,结果显示,患者角膜细菌培养标本阳性检出率为22.1%[5]。山东省眼科研究所的一项研究收录了1997-2005年的1 102例疑诊细菌性角膜炎患者,完善角膜病灶的病原学培养后发现,阳性检出率仅为18.2%[6]。

感染性角膜炎患者经过一段时间治疗后,其角膜上皮已经愈合,此时评估病灶中是否残留病原体及活动性炎症,以此来选择维持治疗或减少用药量甚至停药至关重要。停药过早会因治疗不彻底引起病灶复发,延长治疗时间不仅会增加药物不良反应发生率,也增加了患者经济负担。因此,医生必须对患者病情作出准确的判断,若仅根据临床表现判断病情,要求医生有丰富的经验。而且,病原量减少之后刮片或培养的阳性率会更低,此时行角膜刮片病原学检查,会导致已愈合角膜上皮受到人为破坏,延迟愈合时间,不利于患者视力恢复。

3 共聚焦显微镜的特点和优势

共聚焦显微镜于1986年被学者CAVANAGH应用于观察动物角膜,开展动物实验[7]。1989年,共聚焦显微镜首次被用于观察活体人眼。共聚焦显微镜成像之所以能在细胞水平上进行活体、无创、动态的观察,得益于其分辨率高、放大倍数高、对比度高和稳定性强特点。近年来,共聚焦显微镜受到研究者青睐,被普遍应用于检查结膜、泪膜、角膜及眼睑等眼表系统病变。共聚焦显微镜检查原理为:向检查平面照射一束光线,使用探测仪器接收平面反射和折射光线,光线会在2个外侧面(X,Y)和一个矢状面产生分辨作用,据此得出光线散射情况及点扩散能力。因此,共聚焦显微镜能放大观察病灶内组织细胞平面,通过计算机系统扫描形成病灶影像学资料,助力医生观察分析患者角膜病变情况。面对感染性角膜炎患者,共聚焦显微镜能动态观察该患者角膜的各层结构及角膜病变情况,能为快速治疗感染性角膜炎提供有力的影像证据。

共聚焦显微镜检查有以下优势[8-9]:(1)该方法是一种非侵入性、无须染色的活体角膜检查。患者角膜不需直接接触仪器镜头,而是通过涂抹保护角膜的耦合剂进行检查,其在一定程度上可减少感染风险。(2)检查时间短,全面检查患者角膜情况仅需数十秒至几分钟。(3)该方法具有高分辨率,检查所获得影像资料具有较高的清晰度。(4)功能丰富,能测量角膜厚度,自动分析图像和计算细胞数量。(5)该方法可以截取不同层面角膜组织影像,从组织学水平上展现角膜各层结构,从细胞学上观察细胞形态结构和动态变化。(6)该方法具有可重复性,可在不同治疗阶段对感染性角膜炎患者进行检查,有助于评估疾病进展和及时更新治疗方案。

目前常用的共聚焦显微镜有三大类:串联式、裂隙式和激光式,其中裂隙式和激光式较串联式性能更佳、分辨率更高,因此使用更频繁。

4 共聚焦显微镜在感染性角膜炎中的应用

共聚焦显微镜从细胞水平上直接观察活体角膜的病理、生理学特点,不同的病原学感染有不同的特征[10]。共聚焦显微镜具有高分辨率,可直接用于观察活体角膜组织中体积小至微米级的病原体,为诊治感染性角膜炎提供了重要影像学证据,具有较大的临床应用价值。近年来,应用共聚焦显微镜鉴别感染性角膜炎病原、病灶范围深度、疾病发展阶段、治疗效果等取得了显著成果[11-13]。

4.1细菌性角膜炎 引起细菌性角膜炎的细菌种类繁多、形态各异、体积细小,且病变范围内常伴炎症细胞浸润,因此在共聚焦显微镜下常表现为不易分辨的高反光点[14-15]。其中,最常见的炎症细胞是直径为8~10 μm的粒细胞。为了更好地发现菌体,可以调整光源亮度,降低病灶区的背景反光亮度,从而突出菌体的高亮度反光点。

4.2真菌性角膜炎 在临床工作中,医生能利用共聚焦显微镜检查观察到真菌性角膜炎患者病变处的中性粒细胞、真菌菌丝和分生孢子。其中,在共聚焦显微镜下观察到的真菌菌丝及孢子可分为以下3类:(1)树枝状菌丝。此类菌丝在共聚焦显微镜下的形态特征与光镜下大同小异,通常可在角膜上皮层或基底细胞层观察到直径2~5 μm的树枝状菌丝。树枝状菌丝具有不同角度的分支,分支形态弯曲,粗细均匀,有时可观察到分支间连接成网状形态。(2)直、长线状菌丝。在共聚焦显微镜下可观察到此类菌丝形态长直、粗细均匀,其直径为3~7 μm,多位于角膜浅、中基质层,可见菌丝分隔,周围常伴高反光的炎症细胞。(3)真菌孢子。在共聚焦显微镜下可观察到真菌孢子呈圆形或椭圆形,直径为10~15 μm,易与棘阿米巴的包囊混淆。检查到典型的真菌孢子具有一定难度。有研究将共聚焦显微镜运用于真菌性角膜炎的病原学检查时,可直接观察到96.9%的患者病变处有真菌菌丝或孢子[16-18]。李绍伟等[19]研究显示,运用共聚焦显微镜鉴别真菌性角膜炎具有一定临床意义。KANAVI等[20]研究显示,共聚焦显微镜的灵敏度和特异度分别高达94%、78%。目前能活体检测角膜炎患者角膜浸润深度的方法只有共聚焦显微镜检查。角膜浸润深度与治疗方案的制订及患者预后密切相关,根据此结果能评估患者是否应进一步行手术治疗[21]。

4.3病毒性角膜炎 利用共聚焦显微镜观察病毒性角膜炎患者的角膜,可见病变处出现体积增大的角膜上皮细胞,常伴大量树突状细胞浸润。上皮层偶尔可见到微血管小支,此层神经丛数量常减少甚至消失。浅基质层常堆积大小不一、形态各异的高反光细胞,出现较多纤维甚至呈浅基质层纤维化。

4.4棘阿米巴角膜炎 近年来,棘阿米巴角膜炎患者越来越常见。AURAN等[22]于1994年首次报道用共聚焦显微镜观察阿米巴性角膜炎的图像特征。共聚焦显微镜可清晰观察到典型的棘阿米巴原虫包囊及滋养体大小、形态与结构。棘阿米巴包囊通常直径大于细菌菌体,包囊、滋养体直径分别为15~28、25~40 μm。位于上皮细胞间、上皮下及浅基质中的圆形白色闪光小体,即为典型的包囊[23-25]。包囊直径l0~25 μm,体积常介于浸润炎性细胞和上皮细胞之间,大多数具有双层囊壁结构。MATHERS等[26]运用共聚焦显微镜观察217例疑似阿米巴性角膜炎患者的角膜病灶,结果显示,51例患者病原学检测呈阳性,43例患者角膜刮片镜检呈阳性。PARMAR等[27]以63例疑似阿米巴性角膜炎患者为观察对象,用共聚焦显微镜进行检查,结果显示54例患者病原学检测呈阳性。研究表明,运用共聚焦显微镜诊断阿米巴角膜炎优于传统的角膜刮片法,前者的灵敏度和特异度分别高达90.6%、100.0%[28-29]。辅助诊断阿米巴性角膜炎的重要方法包括共聚焦显微镜检查和角膜刮片。角膜刮片对阿米巴包囊的检出率较高,而滋养体在刮片的过程中易被破坏,不易检出。角膜刮片能检查上皮破损甚至形成溃疡的角膜,但无法检查完整的角膜上皮。该方法只能检出位于角膜浅层的病原体,且无法定位检查病原体的位置深度。共聚焦显微镜是一项可观察早期上皮完整病变的无创性检查,不仅能精准评估角膜浸润深度,还能观察病灶周围组织情况。因此,共聚焦显微镜被广泛应用于辅助诊断感染性角膜炎及评估患者治疗效果与预后情况。阿米巴包囊在病变组织中存活时间长,最长可达31个月,因此,在控制棘阿米巴角膜炎患者的炎症后,仍需继续予药物治疗3~4个月,从而降低疾病复发率,避免疾病迁延不愈[30]。角膜上皮病变修复后,非侵入性的共聚焦显微镜检查在评估患者预后情况方面具有不可比拟的优势。

4.5共聚焦显微镜在感染性角膜炎中的鉴别诊断

4.5.1真菌性角膜炎和细菌性角膜炎的鉴别 真菌性角膜炎患者的病灶区有时可观察到真菌菌丝及孢子,且可观察到以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润,体积较多形核白细胞小;细菌性角膜炎病灶区可见菌体表现为直径1~2 μm的高反光点,浸润的炎症细胞主要为直径为8~10 μm的多形核白细胞[31-33]。

4.5.2真菌菌丝与角膜基质神经及纤维条索的鉴别 当病变角膜组织修复时,角膜基质可产生一些神经及纤维条索,易与菌丝混淆。因此应根据以下特点进行鉴别:(1)体积大小。真菌菌丝体积小,一般直径小于6 μm;而角膜基质神经及纤维条索体积大,直径为10~15 μm。(2)形态特征。在暗背景下可观察到真菌菌丝弥漫分布,呈点状、线状、树枝状或交织成网状的高反应形态,常见菌丝分隔、边界清楚且具有一定的生理弯度;纤维条索具有呈“Y”形分支,上下垂直走行的分布规律,边界模糊且形态长直。(3)反光度及炎症细胞数量。菌丝常反光度高于神经纤维条索,周围常见炎症细胞浸润,而纤维条索周围炎性细胞少。

4.5.3角膜活化细胞与短段状菌丝的鉴别 运用共聚焦显微镜检查,可见角膜活化细胞常位于真菌性角膜炎的角膜组织中,周围常见尖角形、棒状正常角膜细胞。活化的角膜细胞核伸长,表现为长度小于30 μm的梭形形态,细胞排列不具备一定的规律,应仔根据镜下特征的差异,与短、段状菌丝鉴别。

4.5.4真菌孢子与棘阿米巴包囊的鉴别 可根据以下特点鉴别形态相似的真菌孢子和不典型棘阿米巴包囊:(1)体积大小。通过用共聚焦显微镜观察不同类型的病原体,发现真菌孢子的体积略小于棘阿米巴包囊。(2)综合分析。多数棘阿米巴角膜炎患者有角膜接触镜佩带史,镜下可见肿胀增粗的角膜神经纤维,且患者常伴有放射性神经炎。

5 共聚焦显微镜的局限性

5.1患者配合度影响 检查患者角膜病变情况需准确定位。若患者配合度高,则有助于共聚焦显微镜检查,反之,各平面图像的位置极易产生偏差。遇到老年人、儿童及有眼球震颤患者时,应寻找适当的方法提高患者配合度。

5.2角膜透明度、干燥程度影响 影响激光穿透角膜的重要因素包括角膜透明度。若角膜水肿致透明度明显下降,共聚焦显微镜的激光难以穿越角膜,则无法形成清晰的深层组织图像。反之,若角膜过于干燥会降低图像质量。因此,为了提高共聚焦显微镜检查的清晰度及准确性,不仅要提高检查者的技巧,如适当调整背景图的亮度、选择病灶中心及多个观察点,还必须提高患者配合程度,根据病情需要滴用人工泪液等,从而为感染性角膜炎的诊治提供影像学证据。

6 小结与展望

共聚焦显微镜是沟通眼表疾病基础研究与临床应用的重要桥梁,其为活体进行眼表疾病细胞水平的病理诊断带来了革命性变化。利用共聚焦显微镜不仅能观察和分析病原菌、炎症细胞及角膜基质细胞等综合因素,鉴别不同的病原,还可以判断病灶发展的深度,客观评价疾病严重程度,预测疾病转归,在角膜感染的无创快速诊断及治疗中具有不可比拟的优越性。但是,共聚焦显微镜的研究与应用仍面临诸多挑战,仍需加强其在安全性、可重复性及自动检测方面的功能。目前,可通过仪器自带软件对角膜内皮细胞密度进行自动分析,但仍需人工操作相关软件对神经纤维等进行描绘和计数,产生的主观偏倚会影响数据结果。此外,现有共聚焦显微镜成像均为不同亮度的黑白反光点,在分辨大小、形态相似的组织时存在一定难度,如各种白细胞等。

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