一例抗HLA抗体引起的新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜*

阳智芬 邹彬彬 曹丽群 谢毓滨

新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜（neonatal alloimmune thrombocytopenic purpura，NAITP） 是新生儿血小板减少中较为常见的一种，在初生婴儿中发病率约为1/800～1/1 000[1]。NAITP的发病机制与新生儿溶血类似，胎儿遗传自父亲的血小板抗原能够刺激母体产生抗血小板抗体，该IgG型抗体能通过胎盘进入胎儿血液循环与相应的血小板结合，致敏血小板被巨噬细胞吞噬而导致血小板减少[2]。本研究采用血小板抗体检测和基因分析，对1例NAITP患儿及母亲血小板抗体特异性及血小板抗原进行分析，现将结果报告如下。

材料与方法

1 病例 患儿，女，于2020年3月20日出生。其母无输血史，孕2产1，血小板计数为204×109/L。女婴出生时无瘀点瘀斑，出生后第一天、第二天、第四天血小板计数分别为99×109/L、78×109/L、83×109/L。临床疑似为NAITP而送检。

2 仪器与试剂 Ion Gene StudioTMS5二代测序仪（赛默飞世尔科技，美国）、GBOX凝胶成像仪（Syngene，美国）、A24811 PCR仪（赛默飞世尔科技，美国）、洗板机（Tecan，瑞士）、Epoch酶标仪（BioTek，美国）、电泳仪（北京六一）、PlateSpinⅡ平板离心机（久保田，日本）、孵育箱（上海圣科），Luminex200（Luminex，美国）。全血基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技公司，批号S8111）、AllType™ NGS HLA分型试剂（赛默飞世尔科技，批号2149057）血小板抗体检测试剂盒（长春博德，批号20191005）、PAKPLUS血小板抗体特异性分析试剂盒（美国Immucor公司，批号3008388）、人类血小板同种抗原HPA1-18，21试剂盒（PCR-SSP法）（天津秀鹏公司，批号K201911004），LIFECODES LSA试剂盒（美国Immucor公司，批号3009479）。

3 方法

3.1 血小板抗体筛查：采用固相凝集法，严格按说明书要求操作，结果判定标准如下，阳性：指示红细胞均匀平铺于反应孔底部表面；弱阳性：指示红细胞结合区域大于阴性对照; 阴性：指示红细胞聚集于反应孔底部中央形成红细胞聚集。

3.2 血小板抗体特异性分析：严格按照说明书步骤操作，结果判断：Cut-off=NCOD×cut-off Multiplier，OD值≥Cutoff 值则判为阳性。

3.3 HLA-I类特异性抗体检测：利用Luminex平台检测， 严格按LIFECODES LSA试剂盒说明书操作。

3.4 HPA基因分型：按照人类血小板同种抗原HPA1-18，21基因分型试剂盒（PCR-SSP法）说明书操作，取扩增产物5 μL，在2.5%琼脂糖凝胶中150V电泳12 min，使用凝胶成像系统观察结果并拍摄成像。

3.5 HLA基因测序：提取好的DNA使用AllType™ NGS HLA分型试剂按照标准流程进行文库制备、模板制备，在Ion GeneStudioTMS5测序平台上进行二代测序，测序产生的数据使用TSV软件进行分析。

3.6 实验室诊断流程 见图1。

图1 实验室诊断流程图

结 果

1 血小板抗体筛查 采用固相凝集法对患儿及母亲血清进行血小板抗体筛查，结果显示，患儿血小板抗体为阴性，母亲血小板抗体为阳性。

2 血小板抗体特异性分析 其母亲血清经血小板特异性抗体检测分析，结果为HPA特异性抗体阴性，HLA抗体阳性。经Luminex进一步的免疫抗体分析，结果显示该抗体为抗HLA-B60抗体和HLA-Cw7抗体。

3 血小板抗原HPA基因分型 患儿及母亲血小板HPA基因分型电泳图分别见图2A和图2B，HPA基因分型结果见表1。

表1 患儿及母亲HPA基因分型结果

图2 患儿（A）和母亲（B）血小板特异性抗原（HPA1-18，21）基因分型电泳图（PCR-SSP）

4 HLA基因测序 患儿及母亲HLA基因测序结果见表2，结果显示，HLA-A*2402、B*4001和C*0702所编码的抗原可能是导致该例NAITP的抗原。

表2 患儿及母亲HLA基因测序结果

讨 论

NAITP的临床表现主要为血小板减少，可出现瘀点瘀斑，严重时可出现内脏和中枢神经系统出血。胎儿血小板抗原在妊娠16周后开始表达，血小板抗体在孕14周可进入胎盘，因此该病在第一胎时就可发生，其严重程度与母亲的孕产史和抗体类型密切相关。NAITP的诊断主要依靠临床表现和实验室检查，目前实验室检查主要包括血小板计数、血小板抗体检查、血小板抗原基因分型[3]等，本例患儿出生后三次血常规检测均显示血小板计数＜100×109/L，无其他血小板减少的临床表现，其母亲血小板计数为240×109/L，血小板抗体筛查阳性，进一步确定为抗HLAB60抗体和HLA-Cw7抗体，结合患儿HLA基因分型，可诊断为NAITP。本例中患儿血小板抗体筛查结果为阴性，可能是由于患儿体内大多数血小板抗体已与自身血小板结合，血清中游离的血小板抗体浓度较低，因此血小板抗体筛查呈阴性。

血小板表面主要表达两类抗原，一类是血小板特异性抗原（human platelet antigens，HPA），一类是血小板相关抗原，如HLA-I类抗原和ABH抗原。在已报道的NAITP病例中，大部分是由HPA抗体所致，在高加索人群中，80%的NAITP是由抗-HPA-1a引起的，其次为抗-HPA-5a（15%），日本人NAITP的发生主要与HPA-5b（75%）有关，其次为HPA-4b[4]。不同种族人群遗传背景不同，HPA遗传多态性分布具有一定的差异性，目前还未有大数据统计分析导致我国人群NAITP的主要HPA抗体类型，只有一些零星的个例报道。国内周燕等先后报道了一例由HPA-5b引发的NAITP[5]和一例由抗HPA-3a所致的NAITP[6]。此外，近期有研究在胎儿血清中检测出抗CD36抗体，表明抗CD36也可以导致NAITP[7]。

早期有学者认为抗HLA抗体不会引起NAITP，原因是HLA抗原在胎儿组织细胞中广泛表达，抗HLA抗体大部分与胎儿其他细胞反应而不只是血小板[8]。随着研究的深入，研究者相继报道了HPA-3a抗体和HLA-Bw6抗体共同引起的NAITP[9]以及HPA-15b抗体和HLA-I类抗体共同引起的NAITP[10]。后续又有报道分析了四例与母源性HLA抗体相关的NAITP，涉及的HLA抗体有抗-HLA-A11、抗-HLAA2、 抗-HLA-B40、抗-HLA-B15、抗-HLA-B7和抗-HLAB27[11]。在本病例中，抗体特异性分析结果显示患儿母亲HPA特异性抗体阴性，HLA抗体阳性，基因检测结果显示，患儿HPA基因分型为HPA-（1-14，16-18，21）aa-15ab，患儿母亲HPA基因分型为HPA-（1-4，6-14，16-18，21）aa-5ab-15ab，可见该病例中HPA抗原不是引起NAITP的原因。HLA基因测序结果显示，患儿拥有HLA-A*24：02、B* 40：01和C* 07：02三个与母亲不同的等位基因，其对应的抗原分别为A24、B60和Cw7，这三种HLA抗原可能会刺激母亲产生相应抗体。HLA抗体特异性分析结果显示，抗A24抗体未检出，抗B60和抗Cw7抗体呈强阳性。因此结合HLA抗体检测和基因分型结果可确定该病例为由抗HLA-B60抗体和抗HLA-Cw7抗体引起的NAITP。有研究表明，妊娠次数与HLA抗体具有一定的相关性，随着妊娠次数的增加，HLA抗体阳性率呈上升趋势[12]。HLA抗体诱导的NAITP与抗体效价有密切关系，但这类抗体影响胎儿血小板的具体机制还不明确，有待进一步深入研究[13]。

母亲血清中存在针对胎儿血小板抗原的抗体是导致NAITP的主要因素，因此孕期血小板抗体筛查对预防NAITP十分重要。对临床上疑似NAITP胎儿，应进行血小板抗体特异性分析和HPA/HLA基因检测，在考虑HPA 抗体同时，应重视HLA 抗体的因素。

致谢感谢博富瑞公司为该项目实验提供的支持

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突