不同浓度桦木酸对人胃癌MGC-803细胞自噬的影响*

王 琪， 邵淑丽,2Δ， 何孟奇， 黄 鑫,2， 张伟伟,2， 张珍珠,2

(1. 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院, 黑龙江 齐齐哈尔 161006; 2. 抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室, 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

胃癌是一种高度流行的癌症类型，通过侵袭和转移具有很高的死亡率，全世界每年有100多万人新诊断为胃癌[1]。据报道，许多天然产物是潜在的抗癌药，具有高效率，高利用率以及低副作用的优点[2]。例如，姜黄素药理作用十分广泛，可以通过损伤细胞线粒体,使之释放细胞色素C,活化Caspase 3诱导肿瘤细胞凋亡[3]。岩藻多糖通过JAK2/STAT1介导的凋亡和自噬作用改善小鼠肝脏再灌注损伤[4]。因此，开发新型有效的天然抗癌药物具有广阔的应用前景。

桦木酸又称白桦脂酸，是一种萃取自白桦树的化合物。桦木酸具有抗发炎，降糖[5]，免疫调节[6]等作用，其药理作用强，副作用低，在癌症治疗中具有显著的疗效[7]。相关研究显示，桦木酸通过抑制Wnt/β-catenin信号通路蛋白的表达，将胰腺癌细胞PANC-1阻滞于G0/G1期，进而抑制PANC-1细胞增殖[8]。桦木酸通过调节PI3K/AKT信号通路和线粒体途径诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡[9]。然而，桦木酸在调控胃癌自噬方面暂无报道。因此，本研究通过体外加药，检测桦木酸对人胃癌MGC-803细胞自噬的影响，为桦木酸的开发和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

人胃癌MGC-803细胞株购自中国医学科学院肿瘤研究所。

1.2 实验试剂

桦木酸购自北京汉博生物有限公司；RPMI-1640培养基干粉购自Gibico公司；胎牛血清购自以色列Biological Iudustries；总RNA提取试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司；Power SYBR®Green PCR Master Mix试剂盒购自Bioteke Corporation；Beclin-1，LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ一抗，兔二抗购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 细胞培养及药物处理

用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养人胃癌MGC-803细胞，细胞培养在37°C、5%CO2与饱和湿度环境下的细胞培养箱中，根据细胞生长状态进行传代。细胞培养至对数生长期，将细胞分为四组，每组三个复孔，用终浓度分别0 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，30 mg/L的桦木酸处理细胞48 h后，收集细胞样品用于后续实验。

1.4 qRT-PCR检测自噬相关蛋白mRNA的表达

收集桦木酸处理后的细胞，提取总RNA，反转录成cDNA，以cDNA作为模板，进行qRT-PCR检测，所得结果以2-△△Ct方法计算mRNA相对表达量(表1)。

Tab. 1 Primer sequences for qRT-PCR analysis

1.5 Western blot检测自噬相关基因的蛋白表达

将细胞接种到六孔板中，待细胞生长到对数期，用不同浓度桦木酸处理48 h，RIPA裂解液提取总蛋白，SDS-PAGE电泳后将蛋白样电转移至PVDF膜上，5% 脱脂奶封闭1.5 h，Beclin-1，LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ一抗(均按1∶300进行稀释)孵育过夜，PBST洗膜3次，兔二抗(1∶1 000稀释)避光孵育1 h，PBST洗膜3次，用Odyssey IR成像仪避光扫描蛋白条带。

1.6 免疫荧光检测人胃癌MGC-803细胞自噬

将细胞接种到六孔板中，待细胞生长到对数期，用不同浓度桦木酸处理48 h，加预冷的甲醇固定，PBST洗3次。封闭液封闭1 h。一抗4℃过夜，PBST洗3次。二抗避光孵育1 h，PBST洗3次。加50 μl DAPI染细胞核，PBST洗3次。加10 μl抗荧光淬灭封片液，激光共聚焦显微镜下拍照。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 qRT-PCR检测自噬相关基因mRNA表达的影响

利用qRT-PCR检测不同浓度桦木酸作用人胃癌MGC-803细胞自噬相关基因LC3、Beclin-1 mRNA表达。如表2所示，桦木酸处理后，随着桦木酸浓度升高，LC3和Beclin-1 mRNA表达均高于未加药物处理的表达量，并且差异显著，当桦木酸浓度为30 mg/L时mRNA表达量最高。结果表明，桦木酸可显著上调人胃癌MGC-803细胞LC3、Beclin-1基因mRNA的表达(P<0.05,P<0.01，表2)。

Tab. 2 Detection of LC3 and Beclin-1 mRNA expressions in MGC-803 n=3)

2.2 Western blot检测自噬相关基因蛋白表达影响

Western blot检测不同浓度桦木酸作用人胃癌MGC-803细胞自噬分子标志物LC3、Beclin-1蛋白表达水平。如表3所示，桦木酸处理后，随着桦木酸浓度升高，LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达水平以剂量依赖性明显增加，LC3-Ⅰ蛋白表达水平明显减少，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高。结果表明，桦木酸通过调控LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达促进胃癌MGC-803细胞自噬(P<0.05,P<0.01，图1，表3)。

Tab. 3 The effects of betulinic acid on protein levels of Beclin-1, LC3-Ⅰand n=3)

Fig. 1 Effects of betulinic acid on the protein levels of Beclin-1, LC3-Ⅰand LC3-Ⅱwhen MGC-803 cells were treated for 48 hours (n=3)

2.3 激光共聚焦显微镜检测人胃癌MGC-803细胞自噬

激光共聚焦显微镜观察LC3蛋白在胃癌MGC-803细胞的定位及表达。如图2所示，桦木酸处理48 h后，随着桦木酸浓度升高，LC3蛋白在细胞质内形成点状聚集增多，30 mg/L时点状聚集最多。结果表明，桦木酸的处理诱导胃癌MGC-803细胞发生自噬。

Fig. 2 Detection of LC3 protein in human gastric cancer treated with betulinic acid for 48 h(bar=100 μm， n=3)

3 讨论

胃癌是一种常见的恶性肿瘤，通常于晚期发现，使用传统手术和化疗很难提高胃癌患者的整体生存率[10]，且术后易产生化疗药物抗药性[11]。因此开发有效，毒副作用小的抗癌药物刻不容缓。已有研究表明，通过调控细胞自噬可起到肿瘤治疗的目的[12]，如天然植物提取物10-羟基喜树碱，可诱导人膀胱癌细胞的凋亡和自噬[13]，棉酚通过内质网应激抑制自噬来增强抗肝癌作用[14]。细胞自噬的分子机制十分复杂[15]。在自噬过程中LC3是哺乳动物细胞自噬发生的标志物。肿瘤细胞中LC3被处理后可产生胞浆LC3-Ⅰ, 经过类泛素化修饰并与自噬体上的磷脂酰乙醇胺进行共价结合形成LC3-Ⅱ[16]。Beclin-1是一种成熟的核心哺乳动物自噬蛋白，是自噬体形成所必需的关键基因[17]。越来越多的证据揭示自噬在人类疾病的许多病理生理过程中的重要作用，包括神经退行性疾病，炎症[18]，癌症[19]等。

桦木酸是一种作用广泛的天然化合物，可通过抑制硬脂酰CoA去饱和酶(SCD-1)诱导细胞凋亡[20]，具有抗肿瘤药物潜力。本研究通过qRT-PCR和Western blot 进行mRNA和蛋白水平的检测，证明随着桦木酸浓度增加，Beclin-1和LC3 mRNA表达量也增加，而且桦木酸浓度为30 mg/L时表达量最高，Beclin-1和LC3-Ⅱ 蛋白表达量也增加，桦木酸浓度为30 mg/L时表达量最高，但LC3-Ⅰ蛋白表达量减少，桦木酸浓度为30 mg/L时表达量最低。

综上所述, 桦木酸通过上调人胃癌MGC-803细胞LC3、Beclin-1基因mRNA的表达，上调人胃癌MGC-803细胞Beclin-1，LC3-Ⅱ基因蛋白的表达，下调LC3-Ⅰ蛋白的表达，从而诱导人胃癌MGC-803细胞发生自噬。